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标题:【求助】蛋白从来没有表达出来过

89tongzijun[使用道具]
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发表于 2014-5-7 16:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】蛋白从来没有表达出来过


各位大虾：我做蛋白表达共有半年了，从来就没有表达出来过，郁闷中！
我用的载体是pET28a，我把一段基因克隆后直接连接到载体的SacI 和HindIII位点之间，得到的重组质粒直接转化到BL-21感受态中，进行PCR鉴定、双酶切鉴定和测序鉴定，都是正确的。（只是没有经过重组质粒转化到DH5Aa感受态中这一步）。然后进行IPTG诱导，优化了好多条件，蛋白老是表达不出来。不知道问题出在哪儿？请多多高手指点！
现在怀疑是不是在转化到BL-21感受态之前必须要先转化到DH5Aa感受态，然后在进行诱导表达。盼望得到回复啊！
谢谢大家！
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发表于 2014-5-7 16:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

转化到DH5a并不一定是完全必须的，但是如果要长期保存质粒，还是要转到DH5a中。
有个重要的原因是你的蛋白含有稀有密码子，所以不能表达，如果你的蛋白是真核蛋白的话。
建议你用rosetta表达菌株，这样可能就会表达了。
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yonger[使用道具]
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发表于 2014-5-7 16:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

还可以参考
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发表于 2014-5-7 16:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

首先，BL21不是克隆菌，不是recA和endA变异的，所以并不适用于提取质粒酶切和测序，一般都应先转化到克隆菌中，提取质粒再转化BL21；
不过，按照你的说法，测序出来没有问题，应该不是载体的问题；
其次，我有疑问的是，你的蛋白表达出来的结论是如何下的？你跑PAGE，有做空载体空对照么？还有一种可能是表达量非常低，在PAGE上看不出来，你是否可以用6*His的抗体做一个western来检测一下你的蛋白是否有表达呢？western的灵敏度是非常高的。
首先你得真正确定你的蛋白肯定没有表达，再去找其他原因。
我的经验是，大多数实验结果不好并不是实验本身有多难，问题往往出在小处，出在细节上。
祝你成功。
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89tongzijun[使用道具]
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发表于 2014-5-7 16:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢楼上高手的回答。我就是用未加IPTG之前取1毫升菌液离心后做为空白对照，没有用空的质粒对照进行同时诱导表达。
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JK.jon[使用道具]
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发表于 2014-5-7 16:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

有时蛋白表达量很低与未加IPTG之前的空白对照并没有太大的区别,甚至是肉眼难以区分的,但并不能说明没有表达,因为有时空白对照中也有表达.所以用未加IPTG之前取1毫升菌液离心后做为空白对照是不足以说明问题的.建议用转入空载体的DL21菌或纯的DL21菌作对照，这在蛋白表达量低时是很必要的。
如果你的蛋白有抗体最好先做个western检测一下，这是最直接的办法。如果没有抗体，可以考虑做个银染，银染的灵敏度也是很高的，但一定要用转入空载体的DL21菌或纯的DL21菌坐对照才能说明问题。
如果通过western或银染证明是表达了，而只是表达量低，可以考虑优化密码子，即用品PCR方法将目的基因改成在原核中高效表达的密码子，当然如果导师有钱的话可以全序列合成。
如果western或银染证明确实没有表达，就应该考虑一下载体是否有问题了。你已经证明外源片断是正确的了，但不能保证载体没问题，你可以测序看看他的启动子有没有突变，或你们实验室其他用这个载体的人是否也存在这一问题。
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fei1226com[使用道具]
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发表于 2014-5-7 16:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你可以试一下37度,IPTG1MMOL/L诱导过夜.我就这样诱导出来的,不过是四聚体,还没搞明白为什么呢
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tuuu2[使用道具]
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发表于 2014-5-7 16:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
把你的蛋白序列传上来，可以预测以下成功的可能性。
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89tongzijun[使用道具]
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发表于 2014-5-7 16:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
顺便问一下，怎么预测成功的可能性啊？多谢啊！！！不吝赐教。
我的蛋白是酪氨酸酶（tyrosinase）全长去掉前面16个氨基酸（信号肽） 。
今天看了ｐET系统操作手册，上面不建议直接转化到BL-21等表达质粒中，而需要先转化到DH５ａ克隆质粒中，鉴定正确后再转化到表达质粒。也不知道是不是这个原因？
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阿k[使用道具]
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发表于 2014-5-7 16:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你有没有移码啊?
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