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标题:【求助】请做细菌膜蛋白的高手指点

bring[使用道具]
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发表于 2014-5-8 15:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】请做细菌膜蛋白的高手指点


这是我提取全膜蛋白的方法
1. 50mM Tris-HCI pH 7.6 1mM EDTA 清洗4次
2. 50mM Tris-HCI pH 7.6 0.07mM EDTA加DTT浓度到1mM的超声破碎液破碎细菌
破碎程序5 S on/5 S off 75%的功率(小探头)
3. 15000G离心15分钟
4. 上清再离心100000 G 45分钟
5. 用超净水清洗离心沉淀表面之后用双向裂解液溶解.处理后直接跑双向
经过以上处理我跑双向后点非常多应该有几百个,将这样的样品进行比较找蛋白点差异可不可行?
我处理后的样品肯定混有很多的非膜蛋白,这对结果是不是有影响?如果有影响我又该如何改正?
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发表于 2014-5-8 15:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也想做这方面的实验，我以前做膜蛋白时，也是可以得到几百个点。但是问题是我抠点做MALDI-TOF后，却得不到结果，所以看着那么多点，只好发呆，最近暂停了实验，想想是不是用其他方法可以得到这些蛋白点是什么蛋白。
帮你一起顶，希望大家一起来讨论。
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发表于 2014-5-8 15:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #2 u76mp 的帖子

你说的没结果是不是打出来的点都不是膜蛋白,
厦门大学有一个教授彭宣宪他做蛋白质组很有名 是蛋白质组学杂志的审稿人 在上面发了很多文章.
他告诉我提膜蛋白加碳酸纳效果更好
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发表于 2014-5-8 15:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主你好。我也是做细菌膜蛋白的。我的提取全膜蛋白的方法和你基本一样，而且我提的膜蛋白在普通SDS－PAGE上条带很多，很正常。但是做双向时点却很少，只有稀稀拉拉的十几个。但是我做的胞内蛋白组分双向电泳的图却很好。请问在提取膜蛋白后做双向电泳的时候，有没有什么要特别注意的以得到好的结果？不甚感激！
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u76mp[使用道具]
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发表于 2014-5-8 15:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

没结果,是到数据库里收索, 没有找到对应分子量和PI的蛋白质. 所以那些点也不知道是什么蛋白.
或者是我的方法不对,也没人问,所以最近不做了,直接跑SDS-PAGE. 把分开的条带拿到公司去做, 让他们去分析.反正老板出钱.
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xue258[使用道具]
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发表于 2014-5-8 15:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
做以下碳酸盐处理，文献很多
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