蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】帮帮忙看看显影片子

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 13  1/2 12››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】帮帮忙看看显影片子

flyxx05[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 77050
精华 0
积分 270
帖子 199
信誉分 100
可用分 1886
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-12
状态 离线
1

发表于 2014-5-8 16:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】帮帮忙看看显影片子


各位兄弟姐妹，来帮帮分析下原因哈
这是我压的P-ERK的片子
一抗1：500
二抗1：2000
背景好像很高，条带几乎掩盖了，而且会有空泳道
我一抗4度过夜，二抗37度1-2小时
封闭液10%脱脂牛奶
抗体稀释液5%BSA
出现这种空泳道有几次了，不知道什么原因，因为我用半干法转膜，国产仪器，转完可以丽春红染色可以看到每个泳道都有蛋白，哭，请帮帮忙找下原因，先谢谢了
顶部
flyxx05[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 77050
精华 0
积分 270
帖子 199
信誉分 100
可用分 1886
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-12
状态 离线
2

发表于 2014-5-8 16:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
片子在这里


查看积分策略说明
附件
2014-5-8 16:19
58649829.jpg (7.71 KB)
 
顶部
flyxx05[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 77050
精华 0
积分 270
帖子 199
信誉分 100
可用分 1886
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-12
状态 离线
3

发表于 2014-5-8 16:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

上面是MSU刺激的，中间有空泳道
这个是LPS刺激的条带不全


查看积分策略说明
附件
2014-5-8 16:19
46095618.jpg (7.12 KB)
 
顶部
ha111[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 72969
精华 0
积分 821
帖子 1239
信誉分 101
可用分 7048
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-9-16
状态 离线
4

发表于 2014-5-8 16:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

看上去像是转膜效果不好。
建议：
1. 加大半干转的强度。
2. 改用湿转。我们实验的人做过erk，湿转效果很好。
3. 第一张片子感觉有点反白，就是ECL淬灭太快了，可能是一抗浓度太高，也可能是二抗浓度太高。个人感觉前者可能性较大， 改用1：1000试试。
4. 丽春红有时候会骗人。
顶部
jrwyyplt[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 79380
精华 1
积分 406
帖子 488
信誉分 102
可用分 3193
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-12-10
状态 离线
5

发表于 2014-5-8 16:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

建议降低二抗的浓度
顶部
flyxx05[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 77050
精华 0
积分 270
帖子 199
信誉分 100
可用分 1886
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-12
状态 离线
6

发表于 2014-5-8 16:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我们没有湿转装置，请问怎么加大半干转的强度？时间，电流？我用的恒流2mA/CM2.
那请问有空泳道的问题出在什么地方呢，请各位帮帮忙啊
顶部
vvmmoy[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79224
精华 0
积分 825
帖子 1270
信誉分 100
可用分 7255
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-8
状态 离线
7

发表于 2014-5-8 16:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

会不会是在转膜的时候没有将气泡排干净,或者没有将PVDF膜用甲醇浸润20sec,导致转膜没有转上?
顶部
flyxx05[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 77050
精华 0
积分 270
帖子 199
信誉分 100
可用分 1886
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-12
状态 离线
8

发表于 2014-5-8 16:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我甲醇浸润很久的，超过20秒的。转膜时候怎么样能把气泡排的很干净？
转膜到底怎样才能保证每个泳道都能转的上呢？有没有方法和诀窍？
顶部
glass[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76223
精华 0
积分 715
帖子 1109
信誉分 100
可用分 6373
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-2
状态 离线
9

发表于 2014-5-8 16:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果说丽春红染色结果,你的目的条带肯定存在的话,那多数是后面的步骤问题.
1. 杂交的方法,使用杂交袋的话,比较容易出现这种问题,杂交不均匀.
2.可以适当降低二抗的浓度,这是在你有目的条带的基础上.
3.ECL要均匀铺满.
如果说丽春红染色结果,显示蛋白条带本身就不齐全的话,问题可能出现在前面.
1.蛋白的提取
2.转膜问题,是否赶尽气泡之类等等.
个人意见,仅供参考.
顶部
huifeng0516[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76210
精华 0
积分 552
帖子 783
信誉分 100
可用分 4731
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-2
状态 离线
10

发表于 2014-5-8 16:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果是PVDF膜，甲醇浸润至少5min。
转膜时有气泡能阻碍蛋白的转移，会严重影响结果，如：短路、转印不完全等。
气泡排赶，膜和胶间保持湿润，用5ml枪头（圆形管的都可以用）从一端滚动着赶到另一端，可赶出气泡。
我做的都是湿转，望实验成功！
顶部
 13  1/2 12››