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标题:【求助】一个蛋白的原核表达

wmp1234[使用道具]
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发表于 2014-5-8 17:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】一个蛋白的原核表达


最近想做一个人源蛋白的原核表达.载体是pet-28b,卡那抗性的.开始用的是BL21(DE3)做宿主菌.没有表达出来.后来考虑到稀有密码子的问题,换成了rosttablue(DE3)做宿主菌,诱导后,SDS-PAGE考染还是发现没有诱导出来.但是做个WB发现在正确的位置还是有条带的.我改了很多条件.卡那从30,50,100都试过了.培养基LB里也加了1%的葡萄糖防止本底表达.可就是没有明显的结果.
还有就是,我把这个蛋白缺掉了24个氨基酸后就能很好的表达出来.各位,大哥大姐.帮我出出主意啊.我还是想拿到全长的啊
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发表于 2014-5-8 17:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

换载体吧，融合表达也许会有用。。。。
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发表于 2014-5-8 17:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

建议换载体试试
我现在也正在原核表达一种人源蛋白，开始也用His 标签的pet-32a载体，曾经摸过各种条件（诱导温度，时间，IPTG浓度，诱导前菌的生长密度等等），也考虑过稀有密码子的问题，曾经换过表达菌，可就是诱导不出目的蛋白，当时真是很着急
现在换了GST标签的pGEX-4T-1载体就能诱导出目的蛋白了
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发表于 2014-5-8 17:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问楼上的,你的蛋白是可溶的吗?
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发表于 2014-5-8 17:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

SDS-PAGE考染只能检测到ng 级,而western 可以检测到pg级.你的条带再western 中有而PAGE胶中没有,说明表达出来的量太少.你摇的是多少菌?你可以扩大培养后再去检测,肯定会成功的.GOOD LUCK!
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发表于 2014-5-8 17:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

缺掉了24个氨基酸是在哪里，N端还是C端，序列？
我的一个蛋白要去掉N端的40个氨基酸。
换GST融合最可行
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发表于 2014-5-8 17:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 8princess8 于 2014-5-8 17:10 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

缺掉了24个氨基酸是在哪里，N端还是C端，序列？
我的一个蛋白要去掉N端的40个氨基酸。
换GST融合最可行

缺掉的24个氨基酸是一个预测的跨膜区吧.疏水比较强..靠近c端吧.
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发表于 2014-5-8 17:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 ero11 于 2014-5-8 17:09 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

SDS-PAGE考染只能检测到ng 级,而western 可以检测到pg级.你的条带再western 中有而PAGE胶中没有,说明表达出来的量太少.你摇的是多少菌?你可以扩大培养后再去检测,肯定会成功的.GOOD LUCK! ...

我摇的是3ml菌液.表达量太少了,扩大培养到200ml怕也不行呢
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kuaizige[使用道具]
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发表于 2014-5-8 17:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你可以试下让菌长到OD0.6--1.4之间再加IPTG开始诱导 ，此外加入IPTG的浓度也会影响表达量的
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wmp1234[使用道具]
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发表于 2014-5-8 17:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 kuaizige 于 2014-5-8 17:12 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你可以试下让菌长到OD0.6--1.4之间再加IPTG开始诱导 ，此外加入IPTG的浓度也会影响表达量的

我就是0.8诱导的,IPTG的浓度用的是最大量1mM
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