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标题:【求助】帮我看看western那里出错了

bamboo16[使用道具]
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发表于 2014-5-8 17:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】帮我看看western那里出错了


这是我做的akt的western，同样的步骤p-akt做出来了但akt没出任何结果，请各位帮忙分析一下。我的步骤如下：
1.浓缩胶4% 100v 20min，分离胶12% 160v 3h
2.NC膜，100mA，半干转 1.5h
3.4%山羊血清封闭 37度 1h
4.一抗是羊抗人的akt，1：500稀释，4度过夜
5.HRP标记的兔抗羊的二抗 1：400稀释，37度 1h
6.DAB显色
任何条带也不出，整个膜都是花的，到底是哪出错了？

[ 本帖最后由 bamboo16 于 2014-5-8 17:41 编辑 ]


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2014-5-8 17:41
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vvmmoy[使用道具]
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发表于 2014-5-8 17:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

同样的样品蛋白 做内参照看看～～
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zhenxin[使用道具]
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发表于 2014-5-8 17:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这个样子一般是封闭不够充分导致的，建议更换为脱脂奶粉；另外增加洗膜时间和次数。
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bamboo16[使用道具]
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发表于 2014-5-8 17:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

转膜过程会不会也不妥，这样的条件还可以吗？
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yonger[使用道具]
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发表于 2014-5-8 17:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

一抗的来源是羊（山羊or绵羊？），封闭液最好选择其他种属的，不然加了抗羊的二抗后，不出高背景才怪，同意三楼的观点，可用脱脂奶粉，或者BSA；
像一楼说得做个内参，可看看你的蛋白是否降解；
另外可同时做个阳性对照，看看你操作的环节有无问题；
再者，p-akt如果表达比较高的话，那么akt由于被磷酸化了表达必然较低，加大上样量试试。
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发表于 2014-5-8 17:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 yonger 于 2014-5-8 17:44 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

一抗的来源是羊（山羊or绵羊？），封闭液最好选择其他种属的，不然加了抗羊的二抗后，不出高背景才怪，同意三楼的观点，可用脱脂奶粉，或者BSA；
像一楼说得做个内参，可看看你的蛋白是否降解；
另外可同时做个阳性对照，看看你操作的环节有无 ...

这我可不太同意。并不能说磷酸化蛋白高了总蛋白就会低，主要是取决于两个抗体各自的结合位点。例如一个是在N端，另一个在C端，那么磷酸化就绝对不会影响到对总蛋白的检测。
另外二抗1：400，存在疑问。就我所见到过的二抗而言，如果用ECL一般是在5000：1-10000：1之间，DAB则加一倍，在2500-5000之间。用400：1似乎太大了，也可能是背景太高的原因之一。
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+小生怕怕+[使用道具]
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发表于 2014-5-8 17:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
是不是拿胶片的手套上有水或者显影剂？
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bamboo16[使用道具]
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发表于 2014-5-8 17:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
二抗是按说明书稀释的，我又做了一次，转膜时间换为150ma 1.5h，用3%BSA封闭，结果还是没有，膜还是花的？
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bamboo16[使用道具]
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发表于 2014-5-8 17:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这我可不太同意。并不能说磷酸化蛋白高了总蛋白就会低，主要是取决于两个抗体各自的结合位点。例如一个是在N端，另一个在C端，那么磷酸化就绝对不会影响到对总蛋白的检测。

===============================================================================================================

akt蛋白的总量应该是一样的，但是磷酸化和非磷酸化的状态是动态平衡的，p-akt要是高的话，akt就会低，这个我们当时跑磷酸化的蛋白时已经验证过了，设过几个不同的浓度梯度，在磷酸化蛋白丰度非常高的组，非磷酸化的基本不出；不管抗体结合的是N端还是C端，检测的蛋白应该是样同的。不大家有何高见。
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bamboo16[使用道具]
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 小中大
二抗是按说明书稀释的，我又做了一次，转膜时间换为150ma 1.5h，用3%BSA封闭，结果还是没有，膜还是花的？

==============================================================================================================

膜是什么膜，若是PVDF膜没有用甲醇活化好做出来也是花的，最好把过程说得详细一些，比如蛋白分子量大小、胶的浓度、转膜是否充分，做个内参看看是否有带等。
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