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标题:【求助】求助转膜的问题

ii077345[使用道具]
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发表于 2014-5-8 17:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】求助转膜的问题


请教各位，我做akt的western,分子量57kd,用nc膜做半干转，用什么条件比较好，我用100ma转1h及1.5h都没出什么结果？
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junjie05[使用道具]
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发表于 2014-5-8 17:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

35mA 1小时或130mA 3个小时,试试,祝好运!
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zwsyrt[使用道具]
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发表于 2014-5-8 17:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
怎么电流越大，时间越长吗
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kswl870[使用道具]
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发表于 2014-5-8 17:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

200mA ,2小时,试试.
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zwsyrt[使用道具]
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发表于 2014-5-8 17:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
蛋白不会转过吗
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8princess8[使用道具]
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发表于 2014-5-8 17:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

2楼的说法有根据吗?
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发表于 2014-5-8 17:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这个没有一个固定的标准，每个实验室的条件不同，可能使用的转膜条件也各不相同，最好是加上预染marker，根据自己的实际情况，设定几个梯度摸摸，对于57kd的蛋白，恒流半干转还是可取的。
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发表于 2014-5-8 17:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请教各位，我做akt的western,分子量57kd,用nc膜做半干转，用什么条件比较好，我用100ma转1h及1.5h都没出什么结果？

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转膜没有结果首先确定一下你的蛋白的样品有没有问题，比如说测蛋白的浓度以及考马斯亮蓝染胶。
如果确定样品没有问题那就是你转膜的问题了。你的电转缓冲液有问题吗？用之前有没有加甲醇？加20 % (v/v) 甲醇，有助于增加转膜效率和减少胶变形。
用多大的的电流转多长时间，理论上来说是要根据你的膜的面积及所要检测的蛋白的分子量的大小来确定的，半干转的电流大小是按照面积来算的，一般来讲，0.8-3.0mA/CM2，时间是根据蛋白分子大小定的。但是不同厂家型号的转膜仪对于转膜的条件不一定相同，我们实验室的一般都是在150mA条件下转两个小时，分子量大的适当延长一点时间，分子量小的蛋白适当的减少一点时间，一般都转的挺好的。但是在我们楼上一实验室的相同的蛋白150mA至少要转三个小时才可以。
不知道你在转膜时有没有注意电压的变化，如果你的电压一直很低的话，建议你不妨把时间延长到两到三个小时试一试
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greenbee[使用道具]
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发表于 2014-5-8 18:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

150ma 2h会不会转过啊,我用100ma 转 1小时20分，在膜的背面（不与胶接触的一面）才隐约看见很淡的条带，这是不是转过了的表现？
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duoduo[使用道具]
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发表于 2014-5-8 18:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
150ma 2h会不会转过啊,我用100ma 转 1小时20分，在膜的背面（不与胶接触的一面）才隐约看见很淡的条带，这是不是转过了的表现？

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正面呢？没条带？
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