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标题:【求助】MASCOT说肽段信息太多,无法搜索怎么办

Ao7[使用道具]
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发表于 2014-5-8 18:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】MASCOT说肽段信息太多,无法搜索怎么办


做了MS/MS,但是在线搜索MASCOT,显示如下:
Sorry, your search could not be performed due to the following mistake entering data.
Too many peptide masses in your data file. Mascot has a limit of 1000000 but this system has been configured to have a limit of 300 [M00111]
于是,又把生成的mgf文件的参数改了一下,出来的文件小了很多,但是搜索仍然结果同上,这该怎么办呢?
请各位大侠帮忙!多谢多谢!
另外想知道有大侠做蛋白翻译后修饰位点吗?磷酸化或者乙酰化?请问是不是一定要先得到纯化蛋白呢?谢谢啦!
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yjf1026[使用道具]
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发表于 2014-5-8 18:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你得把mgf中的肽段信息手动删除一些，也就是把一个大的mgf分成几个小的mgf。
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发表于 2014-5-8 18:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
可是怎么把大的分成小的呢?
我用的ABI的4000QTRAP,mgf文件是做完LC-MS/MS后搜索时自动生成的文件,可以用什么打开呢?或者说怎么分割呢?
初次做蛋白质组,请大家多多帮助!
谢谢!
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wood533[使用道具]
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发表于 2014-5-8 18:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

用超级编辑器可以打开 打开后和文本文件差不多，详细的我在问问在告诉你。
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zzzz[使用道具]
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发表于 2014-5-8 18:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

找个购买了mascot本地库的地方搜吧
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orangecake[使用道具]
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发表于 2014-5-8 18:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
mgf 是文本格式文件，你可以用notepad，ultraedit,一类的文本编辑器打开。word 大概也可以就是不要改变格式，要存成文本格式就可以。拷贝每300个ms2数据另存一个文件就可以了。
测定蛋白修饰最好是将蛋白提取以下，用IP沉淀一类方法富集，这样容易做出来。在复合物蛋白量不大的情况 很难做的出来。
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orangecake[使用道具]
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发表于 2014-5-8 18:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你也可以用X!tandem检索，没有限制，也可以免费下载到本地。
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Ao7[使用道具]
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发表于 2014-5-8 18:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢大家,我试试后汇报.
请教各位,样品我已经ip过,可是还是有很多别的蛋白呢?再酶解以后测定,搜库结果分高的,匹配的肽段也只有2-3个,很难找到修饰位点呢.我的目标蛋白还是细胞转过质粒后过表达的,但是ip后根本就没检测到,不知怎么回事,搜索结果都是很多的组蛋白和actin,不知道怎么了.很希望能得到你的帮助.谢谢.也希望得到其他高手的帮助.
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ROSE李[使用道具]
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发表于 2014-5-8 18:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1。 IP 后需要用western 去确定IP的效率，只有部分抗体都可以用于IP。
2。IP后还是需要SDS-gel分离后作质谱。
3。IP有很多技巧，最通常的问题是蛋白聚集和protein A/G bead一起沉淀，多是细胞结构蛋白，你的问题大概就在这里。如果你用Ig G做对照，电泳后出现一样的带，那就是有蛋白聚集。
蛋白聚集可以用多种方法去减少，可以根据蛋白部位粗分离，比如胞浆蛋白，膜蛋白分离， 控制蛋白浓度，我通常用1-2 mg/ml浓度，优化裂解液成分，主要是 EDTA, EGTA的浓度，加一抗前后都要高速离心。这部最关键。
4。蛋白修饰是比较难做的，如果你用LCQ一类的质谱就不要去做了。即使看到修饰为点也是丰度很高的那种。 LTQ一类的敏感度高。 质谱鉴定要通过计算得到得到可能precusor的M/Z,把这个list输入到质谱，让质谱就找这些可能的修饰位点。这需要懂质谱的人去做。我在考虑写个小程序帮助计算，不过现在没有时间。手工做也可以就是需要一上午的时间。
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