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标题:【求助】泛素连接thio easter bond(硫醇酯键)在SDS-PAGE...

pou[使用道具]
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【求助】泛素连接thio easter bond(硫醇酯键)在SDS-PAGE...


泛素分子通过thio easter bond(硫醇酯键)连接,想知道这个键结合的牢固程度?在SDS-PAGE中能打开吗?
也就是说,SDS-PAGE后ubiquitin二聚体或多聚体分子的命运如何?“解体” or“linked”?
多谢!
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youyou99[使用道具]
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如果是酯键是肯定打不开.就是普通的硫醚键也打不开.
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^_^ 化学有些生疏了,能问一下哪些键是可以通过SDS-PAGE打开的?
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zhihui小新[使用道具]
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只能打开二硫键.
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pou[使用道具]
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多谢zhihui小新
另学习了
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=7541502&sty=3&keywords=%B5%B0%B0%D7+%B1%E4%D0%D4+%BC%FC')
中的解释,有点明白了。
等WB结果出来再来汇报情况!
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pou[使用道具]
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WB结果出来了!可是新疑惑又来了~
ubiquitin单体分子的分子量是17kDa,二聚体应该是34kDa吧?
可是我却在分子量Marker 的34kDa和25kDa之间,靠近25kDa的位置上(跟另一个28kDa的蛋白分子大小基本一致)检测到条带。
这个条带是泛素蛋白二聚体吗?如果是,分子量的差异由何而来?会是SDS-PAGE上样buffer的影响吗?(2DE检测到的是34KDa大小的)
非常感谢!
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单体泛素分子只有76个氨基酸,分子量应该在0.8kDa左右。靠近25kDa的位置条带应该是三聚体。你可以跑一个15%胶,不要将0.8kDa的单体泛素跑出,western检测会有单体和二聚体泛素出现的。
另,你做的是体外泛素化吗?
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我要回答他的问题.
首先, 硫醇酯键是能够被DTT和b -巯基乙醇打开的,
但是,我不知道泛素单体之间是不是以硫醇酯键连接的.
但是,楼主说''ubiquitin单体分子的分子量是17kDa,二聚体应该是34kDa吧?'' 意思是它应该以两个相同的亚基结合存在?
泛素的分子量是17KD么?我记得是个狠小的肽,查了一下,说只有8KD,
那么2D中的狠可能是四具体,
SDS-PAGE中跑出来的是三具体?8KD狠小,跑不出来了
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找到一段话.
''在细胞中泛素有两种结构形式,既多聚泛素(polyUb)和单体泛素。前者是由单体泛素在特殊的酶催化下,由一个泛素C-末端羧基和另一个泛素的Lys48的ε-NH2结合,形成多到由20个泛素相连的多聚泛素结构''
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summerxx[使用道具]
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再补一段:
''Ub 基因是一个多基因家族,而且都是以融合基因的形式存在(Brett 等,1990) (见图1所示) 。可分为两类,一类被称为多聚Ub 基因(Polyubiquitin genes) ,另一类被称为C2末端延伸Ub 基因(C2terminal extension genes) 。多聚Ub 基因由多个Ub 重复单元(repeat unit) 组成,每个重复单元(228 bp) 编码一个Ub。各个重复单元的核苷酸顺序可以有变化,但由于遗传密码的简并性,其编码的氨基酸不变。在不同物种中,多聚Ub 基因的数目和每个多聚Ub 基因的重复单元数目是变化的。
第二类Ub 基因编码单体Ub 及其C 末端的延伸蛋白。这个C 末端延伸蛋白(carboxylextension protein ,CEP) 有52 个或76~81 个残基。已经确定CEP 是一种核糖体蛋白。实验表明,52 个残基的CEP 是核糖体大亚基的一种蛋白,76~81 残基的CEP 是核糖体小亚基的组成成分。C 末端水解酶加工移去融合蛋白的Ub 部分后,这些延伸蛋白整合进入核糖体中(图1) 。由于这些核糖体蛋白与Ub 共翻译成融合蛋白,很少以非融合形式翻译,因此Ub 被认为在核糖体生物合成中充当一种分子伴侣(molecular chaperone) 。在它们整合进入核糖体之前,有保护稳定这些核糖体蛋白的功能(Hochstrasser ,1995) 。基因研究表明,酵母52 个残基延伸Ub 基因Ubi1 ,Ubi2 对酵母的生存是必需的。76~81 个残基延伸Ub 基因Ubi3 虽是非必需的,但它能强烈促进核糖体20S RNA 前体加工为成熟的18S
RNA。在Ub2C 末端水解酶作用下,多聚Ub 基因产生的泛肽链被加工成单体Ub 并除去最末端的附加氨基酸残基,C 末端延伸Ub 基因产生的融合物被加工成单体Ub 及核糖体蛋白,后者整合进入核糖体(图1) 。
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