【求助】老板严厉要求:纯化出有活性蛋白质

蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】老板严厉要求:纯化出有活性蛋白质

需要登录并加入本群才可以回复和发新贴

打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】老板严厉要求:纯化出有活性蛋白质

dmg[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 74197
精华 0
积分 315
帖子 330
信誉分 100
可用分 2457
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-8
状态离线

发表于 2014-5-9 23:01 资料个人空间短消息加为好友

小中大

本实验室构建一具有抗菌肽功能蛋白质，纯化后page电泳显示一条带，质谱鉴定表达蛋白分子量正确，但一直没有抗菌活性。
构建pet25b，pet32b两个表达载体，分子量11KD，生物信息学分析抗菌功能在N端。
国外发表一篇文献（仅对XLblue有抗菌活性，其它未见报道），N端氨基酸为GE，本实验室构建为YSGE，不知有没有关系。
本实验室上游构建由同事完成，但老板一定要我纯化出有活性蛋白质，急啊啊啊啊啊！！
希望能提供一种思路，或有实验室能提供蛋白质纯化服务，费用好商量。
拜托！

bring[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 74282
精华 0
积分 597
帖子 914
信誉分 100
可用分 5326
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-9
状态离线

发表于 2014-5-9 23:02 资料个人空间短消息加为好友

小中大

要是没有生物学活性，那什么电泳，质谱都仅仅是摆设，大概没用。
先作菌体裂解液的抗菌活性，假如显示诱导产物有抗菌活性，那么可以做纯化工作。纯化蛋白质是有一点难度，但是也充满了乐趣。
还是自己做吧。要是一切都能靠钱解决问题，那我想，下一届的诺贝尔奖得主都是温州老板。

hulu呼噜[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 77048
精华 0
积分 298
帖子 275
信誉分 100
可用分 2196
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-12
状态离线

发表于 2014-5-9 23:02 资料个人空间短消息加为好友

小中大

严重同意楼上的观点
没活性的的东西基本不必抱太大指望

小糖块[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 76231
精华 0
积分 259
帖子 258
信誉分 100
可用分 2056
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-2
状态离线

发表于 2014-5-9 23:02 资料个人空间短消息加为好友

小中大

基因工程生产的蛋白质，很多都是没有活性的，这是因为，虽然蛋白表达出来了，但是，并没有折叠，有些形成了包含体，另外一些虽然在胞质中可溶，但是也没有折叠成正确的构象，这些蛋白当然就不会有生物活性了。
所以，首先你要把纯化好的蛋白看看是不是折叠了，这个你可以第一用CD，看看是不是有二级结构，更准确的是用NMR方法，扫一个一维谱，看看H的化学位移分布。
如果没有折叠，也许你就要考虑或者复性、或者更换一些有可能促进折叠的载体了。
一般来说，只要蛋白折叠了正确的构象，就会有功能了。

cbou876[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 108885
精华 1
积分 376
帖子 347
信誉分 102
可用分 2604
专家分 10
阅读权限 255
注册 2013-5-15
状态离线

发表于 2014-5-9 23:03 资料个人空间短消息加为好友

小中大

抗菌肽在原核里要么表达不出，要么是包涵体，我还是建议你选酵母表达载体或别的吧，以前我们实验室做抗菌肽，在原核没有表达出来，毕赤酵母表达有活性的

tuuu2[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 77597
精华 0
积分 507
帖子 674
信誉分 100
可用分 4211
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-18
状态离线

发表于 2014-5-9 23:03 资料个人空间短消息加为好友

小中大

如果蛋白表达在破菌上清，但是没活性，是否就意味着即使纯化或采取其它办法处理这个蛋白溶液，也很难有活性啊？Shy

leifengta[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 77488
精华 0
积分 514
帖子 748
信誉分 100
可用分 4517
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-17
状态离线