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标题:【求助】western 的问题

vera+[使用道具]
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发表于 2014-5-10 10:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】western 的问题


我的蛋白是７ＫＤ的，做半干转，资料说分子量小的最好用０.２２μm的硝酸纤维素膜，手头只有０.４５μm的，会把蛋白转透过膜吗？
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utt0989[使用道具]
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发表于 2014-5-10 10:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我提供几点,仅供参考:
1.适当的减少转膜时间
2.减少凝胶的平衡时间为10分钟
3.转膜缓冲液中增加甲醇的浓度(最高可达20%),并适当减少SDS的浓度(最小为0.01%)
4.还有的地方说转膜时可以用两张膜,假如第一张转过了,还有第二张,听起来似乎也有道理.
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tie8[使用道具]
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发表于 2014-5-10 10:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我准备做活检标本的western ，看文献说是最少需要100毫克标本。有做过组织的western 的同仁给些意见，多谢！！
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小游abc[使用道具]
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发表于 2014-5-10 10:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
是做IGF-1吗？　　７．６　kD
我的实验也是小分子的，也存在同样的问题．　小胖子说的有道理！！
　用双层pvdf膜可防止小分子物质过了！！！
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vera+[使用道具]
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发表于 2014-5-10 10:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
昨天做的,转了17分钟,竟然没有转过去! 是时间太短了么? 另外,我的硝酸纤维素膜是一面发光,一面无光的,不确定哪面是正面,请指点指点吧!
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pencil菲[使用道具]
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发表于 2014-5-10 10:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
首先建议你小分子的蛋白最好用０.２２μmPVDF膜，此膜对蛋白的吸附能力强，有试剂公司零售单张。
其次转膜缓冲液中增加甲醇的浓度，我用15% 的浓度。
再次，半干转转膜时间不宜过长，30分钟左右。
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pencil菲[使用道具]
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发表于 2014-5-10 10:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

转膜后如何分辨哪面是蛋白面，如果有的是预染Marker最好不过，直接就能识别出来；如果没有用 预染Marker，建议你在跑胶是就记录各道样品名及方向，转膜时把Marker位置剪小口做标记。如果同时转多块膜作不同的标记并记录。以免混在一起忘了，做的结果再好也没用。
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pencil菲[使用道具]
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发表于 2014-5-10 10:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
半干转有恒压和恒流，我习惯用恒流，在转膜过程中电压逐渐增大，最后达稳压
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yueban-1147[使用道具]
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发表于 2014-5-10 10:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

一般不会的，减少转膜时间或降低转膜电压。
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nikonun[使用道具]
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发表于 2014-5-10 10:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
恒流是根据什么来定数据？谢谢
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