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标题:【求助】我的蛋白纯化该选择哪种阳离子交换柱？

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发表于 2014-5-10 11:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】我的蛋白纯化该选择哪种阳离子交换柱？


目前我做的融合蛋白用EXPASY预测PI值是10.13，分子量大约26KD.精氨酸占蛋白总数的10%；是PQE30载体在M15中可溶性表达，蛋白带6HIS，过镍柱，不挂柱。分析了一下，可能蛋白带正电荷，而HIS不能暴露，准备采用阳离子交换柱子纯化，但是实验室没有人做过，不知道哪种柱子适用？请教各位高手。Question
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发表于 2014-5-10 11:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

最好仔细研究为什么不挂柱,你可以选择载量更高的填料,如果你不需要活性可以在变性条件下去纯化,总之最好是先选择镍柱,别的都很难摸条件得到好的结果.
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changlhsyo[使用道具]
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发表于 2014-5-10 11:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
常用的阳离子主要有两种：
一种是CM52，价格比较便宜，但是结合能力稍弱。重复使用的次数比较少。
一种是SP，价格比较贵一些，但是结合能力比较强。比较推荐。
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veiwu[使用道具]
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发表于 2014-5-10 11:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

BIO-RAD的镍柱做了3次，每次到最后洗脱的时候，根本收不到蛋白，跑电泳，什么都没有。我的蛋白是要做功能的，所以我收的是可溶形式 的，在非变性条件下纯化的。变性的话又要面对复性的问题，想跳过这个步骤。
载量更高的填料是哪种？
sp选择哪家公司的，可以推荐一下下？？
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bangqi_k[使用道具]
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发表于 2014-5-10 11:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你的蛋白等电点高，用阳离子交换比较容易分离，因为自然界多数蛋白等电点都偏酸。可能使用SP（强阳）或者CM（弱阳）柱在中性或偏碱环境中试试。这两种填料首选用GE（以前安玛西亚）的sp-sepharse或cm-sepharose，型号可先选fast flow来试试。
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发表于 2014-5-10 11:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢，我也准备用sp-sepharse FF试试。
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嗅嗅[使用道具]
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发表于 2014-5-10 11:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

还请教一个比较傻的问题，我的蛋白做细胞功能，镍柱我一般500ul就可以做一次纯化，那sp-sepharse FF柱子用来纯化，一次需要的量是多少？我要买多少的包装量？
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veiwu[使用道具]
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发表于 2014-5-10 11:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我建议还是做亲和,目前我没有遇到是挂不上的带his标签的蛋白,一个公司的填料不能代表所有的填料不行,离子交换不能使你一次得到纯品,然后又加凝胶柱子等,这样就没完了Smile郑重考虑.如果你实在没选择的话,你可以考虑到cuturl('www.wsac.cn') 上去看看,你选一份新的镍琼脂糖凝胶试试.我也见过用一些填料挂不上,但是换个填料就可以的.每家公司的填料都有不一样的地方,并非都适合自己的蛋白,这就需要找专业公司的原因.还有上样的浓度不能太少了,见有个人是这样的原因,加大上样量就解决.所以不能轻易放弃.
还有按你说的只用那么点量,估计你不是过柱子的方法,如果你样品浓度不高,而填料又少,这样混合的方法是难吸附很好的,需要多用点填料,用过柱子的方法更好.
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发表于 2014-5-10 11:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

恩，能做出来最好了，我也不想那么麻烦。
我再做做看，QIAGEN和bio-rad的我都用过，，
我一般诱导300ml的菌，全菌电泳蛋白量还不错，条带很粗，然后超声后全部上柱，实验室其他的组也是用的500ul的bio-rad的镍柱纯化，效果很好，但是我的就是不行。
按照veiwu的说法，我诱导500ml菌，然后填料量加大，那要用到多少呢？好像柱子比较贵，老板比较心疼...
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veiwu[使用道具]
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 小中大

至少也要用2-5毫升,可以提高缓冲液pH8-9,延长作用时间也许会好点.
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