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标题:【求助】蛋白原核表达的问题

am10[使用道具]
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发表于 2014-5-10 15:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】蛋白原核表达的问题


最近作原核表达，目的蛋白有诱导且量不大，但跑胶目的蛋白上方还有一个大片段条带很亮，过Ni柱去不掉，用HIS抗体WB检测并没有信号，说明此片段没带HIS标签，下面的小片段WB有信号，可能是降解产物，但大片段是什么呢？过了FPLC都分不开，请告人指点，谢谢！
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发表于 2014-5-10 15:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

是否是降解可以从蛋白质序列做初步分析，可否提供序列?大分子量的条带原因很多，要具体分析。
用GST融合蛋白可以使表达效果发生很大改变，如果条件许可建议试用。
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发表于 2014-5-10 15:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

既然WB检测没有信号，那说明它不是目的蛋白的多聚体。
洗脱条件是什么？是不是你直接用高浓度咪唑洗脱？
Ni亲和层析的特异性应该还好的，用咪唑分段洗脱是可以达到纯度的。
还有，“过了FPLC都分不开”是什么意思？FPLC只是一部仪器而以，要求不高的话可以用蠕动泵＋紫外监测仪代替。
如果确实是它与Ni柱的结合力与目的蛋白非常接近，那就考虑再用离子柱或疏水柱分离，这两种层析柱比较好操作些。
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发表于 2014-5-10 15:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
十分感谢，我是用20mM咪唑直接洗脱的，没做过分段洗脱，是不是从5mM到20mM梯度洗脱呢？过分子筛收集的两个峰的蛋白再跑胶仍有很多条带，所以怀疑分子筛未起作用。
另外s6044，我将蛋白序列站内短信发给你，麻烦你帮忙分析一下，万分感谢！
谢谢！
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发表于 2014-5-10 15:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
20mM咪唑直接洗脱的太低了吧用400吧。20mM咪唑是用来洗的
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发表于 2014-5-10 15:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

写错了，250mM洗脱的
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发表于 2014-5-10 15:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
十分感谢，我是用20mM咪唑直接洗脱的，没做过分段洗脱，是不是从5mM到20mM梯度洗脱呢？过分子筛收集的两个峰的蛋白再跑胶仍有很多条带，所以怀疑分子筛未起作用。
另外yellowsea，我将蛋白序列站内短信发给你，麻烦你帮忙分析一下，万分感谢！
谢谢！
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最好作分段洗脱，比如说分别用50、100、150、200、250mM浓度洗脱。如果用梯度洗脱，浓度斜率尽量小，也就是从20mM到250mM的时间尽量长。
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发表于 2014-5-10 15:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不好意思，我好久没用PM了。
QR*****EED此段是coil区，而且rsrsp排列，是不稳定肽链。
整体看该蛋白后部不太稳定。
前部与××酶同源，后部特异性，很多pro，有功能调节作用。你还是用gst融合试一下比较好。
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发表于 2014-5-10 15:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
十分感谢，我是用20mM咪唑直接洗脱的，没做过分段洗脱，是不是从5mM到20mM梯度洗脱呢？过分子筛收集的两个峰的蛋白再跑胶仍有很多条带，所以怀疑分子筛未起作用。
另外yellowsea，我将蛋白序列站内短信发给你，麻烦你帮忙分析一下，万分感谢！
谢谢！
最好作分段洗脱，比如说分别用50、100、150、200、250mM浓度洗脱。如果用梯度洗脱，浓度斜率尽量小，也就是从20mM到250mM的时间尽量长。
我用分段洗脱，从20-400mM都试了，从50开始到400都能洗出非特异性带，且比我的目的条带亮很多，真不知道该怎么做了。
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am10[使用道具]
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发表于 2014-5-10 15:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
最好作分段洗脱，比如说分别用50、100、150、200、250mM浓度洗脱。如果用梯度洗脱，浓度斜率尽量小，也就是从20mM到250mM的时间尽量长。

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我用分段洗脱，从20-400mM都试了，从50开始到400都能洗出非特异性带，且比我的目的条带亮很多，真不知道该怎么做了。
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