小中大磷酸化蛋白ＷＢ和非磷酸化的一样，并没有什么特别的，考虑以下方面：
1.1 mmol/L Na3VO4配制有没有问题，Na3VO4是磷酸化酶抑制剂，其配置有一实的特点，Homemade phosphatase inhibitor cocktail
Sodium orthovanadate activation:
• in 20 ml lysis buffer add 100 μl of 200 mM stock of sodium orthovanadate activation and final concentration is 1 mM
• 200 mM Sodium orthovanadate activation stock (MW 183.9)
o 0.37 g into 10 ml H2O
o adjust pH to 10 (solution becomes yellow)
o boil solution until it turns colorless (~10 min)
o cool to R.T.
o readjust pH to 10.
o repeat steps 3, 4 and 5 until solution remains colorless and pH stabilizes at pH 10 PRC CORE Page 4 of 9 LAB
o store activated orthovanadate as aliquot at -20°C (300 μL in each aliquot)
如果不按上面的方案来进行，则没有将其激活，那么他是不具备酶活性的，这样你的磷酸化蛋白很快就被去磷酸化，当然检测不到。
2.可能抗体浓度不合适，不然怎么连非特异条带都没有，顺便问一下，有没有泳道。如果没有，很可能操作或抗体有问题。
3.目的蛋白分子量是多大的，400mA会不会把蛋白转过
