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下面的一篇文章也许对你有用。
我觉得你应该再分析一下你连接好的载体，看看插入的目的基因片段是否是完整的ORF，其次要注意在酶切位点的连接处是否造成移码突变从而导致转录提前终止。
影响外源基因在巴氏毕赤酵母中表达的因素：
1、外源基因特性
外源基因在Pp中表达时，其自身就是影响表达水平的重要因素。不同的培养基配方、发酵参数和饲养方案主要是通过提高细胞绝对总数而并非单个细胞产率来提高外源蛋白的产量。Fahnestock等发现随着外源的蛛牵拉丝蛋白基因拷贝数的增加，其生产效率会相对有所降低。另外，许多高A+T含量的基因常会由于提前终止而不能有效转录引;不合适的mRNA5'非翻译区的核苛酸序列和长度也可能会便基因的表达不尽如人意。提前终止被认为是一种具有种属特异性的现象，譬如在Pp中不能表达的HIV ENV蛋白在啤酒酵母中却表达良好。因此，可以通过调整高A+T含量区的核甘酸组成来避免提前终止的发生。而Sreekrishna等通过调整人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)的mRNA5'非翻译区与醇氧化酶(alcohol oxidase 1，AOX1)的5'非翻译区相同后，HSA的表达量可以提高50倍以上。但遗憾的是，限于目前对Pp的了解程度，仍然无法预见某种外源蛋白是否能在其中获得高产甚至仅仅能否表达。至仅仅能否表达。
2、表达框的染色体整合位点和方式
虽然相对于自主复制载体来讲，整合性载体的转化率较低，但由于Pp没有天然质粒，所以设计表达载体偏向于染色体整合，通过同源重组，载体整合到细胞染色体中间。整合性载体具有表达框稳定和可控制整合位点等优越性，并且能够发生多位点整合而获得多拷贝。
AOXl和组氨酸脱氢酶(histidinol dehydrogenase , HIS4)基因位点都已被成功用于表达外源蛋白。Sreekrishna等注意到his基因座的lacZ表达框偶有缺失。这种缺失源于表达框中his4染色体突变拷贝与完好的his4基因的基因转换。因此，看起来aox1位点是较为理想的位点。
3、宿主菌的甲醇利用表型(Mut＋和MutＳ)
用末端与aox1基因5'和3'端同源的线性DNA转化Pp HIS4菌株可导致Mx1结构基因的特异性剔除。aox1基因缺失的酵母在甲醇限制性培养基上生长缓慢(methanol utilization slow , MutＳ或Mut-)，它们只能利用弱的aox2基因启动合成aox2基因启动合成AOX；而aox1基因完整的酵母则生长正常(Mut＋)。原则上，如果是胞内表达，应尽量用Mut－细胞，这样得到的蛋白产物中醇氧化酶蛋白量较少而目的蛋白量相对较多(约占Pp总分泌蛋白量的30-90%，如人乙酰胆碱酯酶B变异链的含量占到90%，使下游纯化更易进行。当诱导AOX1时，转化子不能同时高水平产生酒精氧化酶和外源蛋白，与野生型Mut＋比较，Mut－细胞对氧的要求亦较低，生长也较慢。为解决这个问题，Jeffrey等用甲醇加甘油混合饲养，得到了255mg/L的CD40配体(CD40L)。但由于甘油可部分阻遏aoxl启动子，蛋白表达可能并不处于最佳水平。Sreekrishna等最近运用山梨醇和甲醇混合批量饲养发酵，在不到4个星期的时间里，他们用一个4L的发酵罐连续完成了几个周期的生产。在这种发酵方式中，大部分碳源由山梨醇提供，减少了总的甲醇消耗，因而效率大大提高。
最近，一种无需甲醇诱导而能组成性表达外源蛋白的毕赤酵母载体pCAPZ和pGAPZa已经构建成功，组成性表达的蛋白量与该蛋白对酵母菌的毒性有关。研究发现它们常能生产比诱导型载体pPICZ和pPICZa更高的外源蛋白。这些载体均利用了编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因的启动子。Doring等分别用pGAPZB和pPICZB来生产兔肾肽转运蛋白（rPEPT2）以及人小肠肽转运蛋白(hPEPT2),结果发现，前者表达的此两种蛋白的产量均比后者高4倍。看来在生产哺乳动物膜转运蛋白时，pGAP比pAOX1更理想。
4、基因剂量
许多实例表明，含单拷贝表达框的宿主菌足以得到最佳产量，而在大多数情况下，随着拷贝数的增加表达产物量也会相应增加。Jeffrey等发现，重组CD40L的最高产量是在含有8个以上表达框的菌株中获得的。Clare等的实验结果也表明，重组鼠表皮生长因子(mECF)在Pp中的表达量与其基因量成正相关，而高拷贝、高表达量的宿主菌株可以通过一种快速DNA斑点杂交的筛选方式获得。不过个别情况下拷贝数增加对产量也会产生负效应，似乎表明分泌效率低的蛋白在过高表达的情况下会对分泌途径形成负反馈抑制。
因此，基因拷贝数对表达量的影响是无法预测的。高表达菌株的筛选只应以表达的蛋白量为唯一标准。Jeffrey等建立了一种双滤膜筛查方法，首先将菌落转在醋酸纤维素膜上，再与硝酸纤维素膜叠放在酵母固体培养基上，经过一段时间的培养，分泌蛋白就印在硝酸纤维素膜上。再用此蛋白的抗体检测，即可挑出最高蛋白量对应的克隆。用这种方法，每套滤膜可筛选100-1000个克隆，从而快速地从大量重组菌株中筛选出高表达克隆，并从每升发酵上清液中获得了255mg的重组cD40L。
5、分泌信号
对于一个原本就不能分泌的蛋白来说，采用分泌方式生产是非常困难甚至是不可能的。但为了下游工程处理的方便，外源蛋白的生产应尽量考虑采用分泌表达的方式。有些情况下外源蛋白自身的信号肽就足够了。如果不能利用自身信号肽，那么酿酒酵母转换酶或a配对因子(AMF)的前导序列可以非常有效地引导体积稍小的产物出胞。一般情况下，应用酵母特有的分泌信号表达外源基因获得成功的可能性大。
但酵母表达基因工程产物的另一问题是信号肽加工不完全，其表达的外源基因产物常比设计的多几个氨基酸。这可能是酵母细胞自身调节机制对外源基因高表达的应答表现。Singh等通过定向缺失诱变MFa1和干扰素基因连接处寡核甘酸导致了含有天然N端的成熟干扰素的正确释放，可以成为解决这一问题的一种好方法。
