【求助】细胞破碎后分离蛋白的方法

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标题:【求助】细胞破碎后分离蛋白的方法

雪花子[使用道具]
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发表于 2014-5-15 15:10 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请问各位战友，我用5000r/min的速度来沉淀蛋白，再跑非变性胶，但什么都没有，怎么回事啊，我该用多少的速度来沉淀阿

flower-201[使用道具]
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发表于 2014-5-15 15:10 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你破碎的是什么细胞，会不会降解？

雪花子[使用道具]
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发表于 2014-5-15 15:11 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我破碎的是e.coli细胞

hold住[使用道具]
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发表于 2014-5-15 15:13 资料个人空间短消息加为好友

小中大

离心时间多久？5000r/min，5min应该就有沉淀了。如果只是想要收菌检测是否表达，尽可以10000rpm离心1min就可以了，高速又不会对蛋白有什么损害的。而且，菌体沉淀是肉眼可以看到的呀。
所以电泳没有东西（什么都没有），电极有没有接反了？loading buffer有没有问题？

fsdd817[使用道具]
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发表于 2014-5-15 15:13 资料个人空间短消息加为好友

小中大

同意楼上的说法
尽可以10000rpm离心1min就可以了，高速又不会对蛋白有什么损害的

kuohao17[使用道具]
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发表于 2014-5-15 15:15 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请问各位战友，我用5000r/min的速度来沉淀蛋白，再跑非变性胶，但什么都没有，怎么回事啊，我该用多少的速度来沉淀阿

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您是沉淀蛋白呢还是沉淀破碎的细胞？
5000 rpm，g force是多少呢？rpm没有多大意义；
什么也没有？是什么情况？

tangxin_80[使用道具]
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发表于 2014-5-15 15:16 资料个人空间短消息加为好友

小中大

细胞破碎所选用的方法很重要，如果是超声破碎蛋白会很容易分离出.注意超声时间.如果想要离心破碎的细胞内容物离心选择,10000rpm 5min.去定量跑SDS电泳,跑时可以观察MARKER有无,来判断你所配制的胶是否成功^.^
PS:你的5000RPM沉淀中不是蛋白吧,破碎的细胞沉淀里面或许有你需要的蛋白(不太可能)，但含量微少,大部分应该在上清中。

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发表于 2014-5-15 15:16 资料个人空间短消息加为好友

小中大

e.coli细胞表达的蛋白如果是包涵体才会沉淀，可溶的肯定在上清。一般情况下沉淀和上清都要跑电泳去验证，包涵体和可溶表达有可能同时存在，也有可能相互转化。

moonlight45[使用道具]
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发表于 2014-5-15 15:17 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 yjf1026 于 2014-5-15 15:16 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

e.coli细胞表达的蛋白如果是包涵体才会沉淀，可溶的肯定在上清。一般情况下沉淀和上清都要跑电泳去验证，包涵体和可溶表达有可能同时存在，也有可能相互转化。 ...

如果是膜蛋白，而重悬buffer里面没有合适的detergent的话，也是会在沉淀里面的。