蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】GST融合蛋白纯化不出来

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 21  1/3 123››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】GST融合蛋白纯化不出来

rxcc33[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79965
精华 0
积分 633
帖子 885
信誉分 100
可用分 5303
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-18
状态 离线
1

发表于 2014-5-15 16:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】GST融合蛋白纯化不出来

我要纯化的融合蛋白加GST一共100多KD。做了一个多月了还是纯化不出来。给我质粒的那位学者说这种蛋白很容易被水解，诱导表达后跑SDS-PAGE看不出增强带，建议我直接纯化然后再跑电泳。可是我纯化后跑电泳还是看不到任何带。我个人认为要是蛋白降解导致没有带的话，至少应该能在电泳后看到GST或者其他降解片段，可是我却没看到任何条带。我在诱导时已经加了1mM的PMSF，而且在裂解液里把实验室有的蛋白酶抑制剂都加了， 还是没什么用。这位学者很友好，把他们的实验方法也给我了，其中就是一种抑制剂不一样，他们用的是AEBSF我用的是PMSF。我是束手无策了，各位有什么高见救救我吧。 非常感谢！
顶部
hold住[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75093
精华 0
积分 566
帖子 832
信誉分 100
可用分 4962
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-19
状态 离线
2

发表于 2014-5-15 16:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
本人认为降解不会降解得那么厉害吧,估计是你的蛋白质根本就没有表达,你最好摸一下诱导表达的条件.
顶部
小糖块[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76231
精华 0
积分 259
帖子 258
信誉分 100
可用分 2056
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-2
状态 离线
3

发表于 2014-5-15 16:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

首先确定，质粒的确已经转染了。
质粒一样是不够的，表达菌株也是很重要的。请问用的是一样的表达菌株吗？
如果是原核，BL21就可以，如果蛋白有毒性，用BL21（plys）会好一些。
如果是真核蛋白，建议用rosetta菌株。
如果你确定用的条件一样，你可以诱导后一个小时取样，即使讲解，也不会降解的这么快，否则就是你的蛋白根本没有表达。
顶部
rxcc33[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79965
精华 0
积分 633
帖子 885
信誉分 100
可用分 5303
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-18
状态 离线
4

发表于 2014-5-15 16:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的蛋白是人源的，表达用的是BL21。诱导表达后杂GST发现在正确的位置上根本没有带，而是在分子量较小的位置上有些带，但是位置肯定不对。说明可能没有表达，至于为什么能杂出GST，我不能解释。诱导条件我也摸索过，低温也试过。请问novel1115，你认为诱导条件应该还怎么摸索啊，谢谢！
顶部
rxcc33[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79965
精华 0
积分 633
帖子 885
信誉分 100
可用分 5303
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-18
状态 离线
5

发表于 2014-5-15 16:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问楼上：（1）我转化了BL21后提取的质粒经过酶切切出的带奇形怪状的，全质粒感觉位置对（其他同学也说BL21提的质粒就是这样的，不能说明问题）。你遇到过吗？
（2）至于毒性怎么确定可能没有吧，因为转化后长得挺好的。还应该怎么确定有没有毒性？
（3）你建议用rosetta菌株中的哪种？
非常感谢！我在线等你们回贴
顶部
小糖块[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76231
精华 0
积分 259
帖子 258
信誉分 100
可用分 2056
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-2
状态 离线
6

发表于 2014-5-15 16:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
真核蛋白最好不要用BL21，用Rosetta(de3)就可以了。
如果蛋白有毒性，诱导之后，od会长的很慢。甚至降低，你的应该不是。
你可以用pCRtest一下就可以了。
顶部
小糖块[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76231
精华 0
积分 259
帖子 258
信誉分 100
可用分 2056
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-2
状态 离线
7

发表于 2014-5-15 16:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

根据你说的情况，我建议你换ROsetta，你可以查查是不是你的测序序列中是不是有稀有密码字，存在一种可能，你的蛋白表达到稀有密码子就停止了。
顶部
rxcc33[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79965
精华 0
积分 633
帖子 885
信誉分 100
可用分 5303
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-18
状态 离线
8

发表于 2014-5-15 16:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
非常感谢小糖块！我已经定了引物，可以做。
如果像你所说的有稀有密码子的话，有没有可能表达啊？给我的protocol也是转染BL21的。
顶部
rxcc33[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79965
精华 0
积分 633
帖子 885
信誉分 100
可用分 5303
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-18
状态 离线
9

发表于 2014-5-15 16:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我查了蛋白的CDS区，发现721个密码子中有55个稀有密码子。用Rosetta(de3)就可以补充了吗？有人说用Rosetta2啊。请问我到底该用哪种Rosetta？谢谢！
顶部
987789[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 75248
精华 0
积分 479
帖子 598
信誉分 100
可用分 3870
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
10

发表于 2014-5-15 16:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
有3个可能：
1你的蛋白可能没有表达。
2绝对不是完全降解，你可放宽心。
3可能纯化过程中没有结合。
大蛋白的表达本身就是一个难题，你的分子量大于10万，还是异源，给表达造成难度。我不知道你为什么要采用融合表达，估计也是为了增加融合蛋白的溶解度，但是由于分子量大，在原核细胞里的折叠一定有问题。很有可能结构的原因导致纯化过程中没有结合。
大蛋白的确容易降解，更容易受到蛋白水解酶的攻击，但是没有那么快，只要表达收集后快速纯化就可以了。无论你将来的规模多大，都要少用抑制剂。
建议：从上游找原因。
顶部
 21  1/3 123››