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标题:【求助】关于pull down 的问题

fox_79[使用道具]
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【求助】关于pull down 的问题


导师让我做一个关于受体机制的研究,就是研究细菌素的杀菌方式是否需要受体的参与。他提供的技术路线是pull down 技术。我最近通过看一些资料。知道还可以采取酵母双杂交技术。而且以前有师兄已经用这个做过了,没成功。我的问题是:酵母双杂交技术的验证效率与pull down 有什么区别??我按照文献的方法,设计了蛋白质与Fc的融合蛋白,下一步是固定在protein A-Sepharose beads上,可是师姐说这一步在我们实验室不能实现,可是我觉得根据大家的描述这一步应该不难吧?条件也应该要求不苛刻啊!!请教!!据说,这一步还需要抗体的参与?具体的实验步骤是什么?是选用GST pull down 好,还是采取上述方式好啊?有什么区别么?现在是否是受体机制还不一定,所以未知受体蛋白的具体信息。。。。。。。
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remenb[使用道具]
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我之前也做过pull-down,也是试图寻找一个蛋白的伴侣分子,与楼主的很相似,这个伴侣分子存在否性质如何也是未知
我的蛋白是加了his-tag,用his beads 纯化的,感觉GST-tag并不是很好,因为标签本身分子量较大,容易影响你的蛋白
我用这个方法也调到了一些蛋白,可是这种技术假阳性很高,对于结果还要进一步排除认证
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fox_79[使用道具]
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那就是说:加的tag影响蛋白质的构象,但是对提取(pull down)效果来说,都差不多了??选什么tag,就要用相应的柱子,是么??那加FC片段与his效果也差不多了??
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fox_79[使用道具]
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我的探针蛋白大约2Kb,是选用哪种好啊?his ?GST?还是Fc?
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fox_79[使用道具]
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而且看完GST pull down 的草案了,也没有用老师所说的可怕的十根管子的东西啊!!pull down 柱??
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ladyhuahua[使用道具]
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个人觉得还是不要用柱子,柱子贵,而且在做pull-down的时候首先要把诱饵蛋白挂上去,也就是所谓的纯化,我们当然希望看到纯化的效果怎样,这直接影响到后面能否掉到你要的蛋白。而你如果用柱子的话你想看纯化结果就要把蛋白洗下来,取一部分跑胶,剩余部分要透析除去洗脱液成分后才能再被挂上去,麻烦啊,而且蛋白可能又有损失
如果用散装的beads的话,想看纯化效果,只要取一点beads,煮沸取上清跑胶即可,剩余的beads接着做pull-down
2kb左右蛋白还是有点大的,用GST问题应该不大,不过还是很难说,我是觉得his才6个aa,对你蛋白结构的影响应该会小点,而且它的结合效率也不错的啊;Fc我没用过,不是很清楚
选不同的tag是要选用相应的柱子,
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fox_79[使用道具]
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只能说:哇!!好人真多!嘿嘿。谢谢!!看看我的这篇参考文献的图,不是说,怎么有那么多条带啊?以下是描述:
Figure 1. IDE Interacts with the Extracellular Domain of VZV gE but Not gB or gH
(A) The extracellular domain of gE fused to the Fc portion of human IgG (gE-Fc) bound to protein-A Sepharose was incubated with a cell lysate from melanoma cells, and proteins that bound to gE-Fc were resolved on SDS-PAGE and stained with Coomassie blue. A 120 kDa cellular protein is present in the cell lysate that interacts with gE-Fc.
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fox_79[使用道具]
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"不是说",后面掉了一句话:只有一条带么??难道是因为文献用的是柱子的问题??
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remenb[使用道具]
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可能是这个标签特异性不高,也可能是其他条带的蛋白浓度较高,漂洗没有完全,所以残留在上面。
可是通过与对照的比较,我们是很容易看到试验组多了一条带,而且是很明显的,所以还是可以说明问题的
不过pull-down下的条带是需要进一步检验的
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fox_79[使用道具]
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我正在跟老师讨论这个方案,不知道一般pull down高手们做需要多长时间??我这种菜鸟型的哪??
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