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标题:【求助】帮我看看,我的胶怎么了?

koook5695[使用道具]
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【求助】帮我看看,我的胶怎么了?


都是按以前的方法做的,以前效果都还好的。但是不知道为什么,这次做了几块胶,都是这样。点很奇怪,很多纵条纹。大家帮我看看,是平衡的缘故,还是胶没做好的缘故?怕下次做出来又这样,就又浪费很多


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电泳槽不干净,会在大范围内出现纵纹。
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is2011[使用道具]
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IEF可以的,问题出在二向SDS-PAGE中,估计是电泳中的Tris-HCl配的pH值不准确及质量不够好影响SDS-PAGE胶的分离效果.反正重新配一些新的试剂来进行SDS-PAGE.
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leifengta[使用道具]
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好像是配胶的试剂有过期的,好好检查一下你的AP和TEMED,很可能是TEMED不新鲜了。
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mogu[使用道具]
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TEMED不新鲜也会出现条纹吗?
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okhaha[使用道具]
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以前没有纵向条纹?你用的样品同以前一样吗?怎么觉得像核酸导致的背景拖迹
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koook5695[使用道具]
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7
 

谢谢大家的意见!
这次是我唯一一次电泳液用第二次的,以前都用一次(但是实在太浪费了)。结果就成这样。
后来,我又换新的电泳液跑了二向,但同时也换了平衡母液,结果问题就解决了。
所以我现在不知道到底是平衡的问题,还是电泳液的问题(电泳液我在室温放了三天跑二向的)。如果是电泳液的问题,以后就不敢用第二次,但每次二十五升(伯乐的电泳槽),实在吃不消啊
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moonlight45[使用道具]
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8
 

你说的平衡母液是指什么?第一向完成后第二向之前的两次平衡(分别含DTT和碘乙酰胺)吗?那个只能用一次。不过体积很小,应该是可以承受的。
至于电极液,你跑完一次电泳后用分别收集了内液和外液,用pH计测一下就会发现,内液pH升高而外液pH降低。原因是阴阳两极电解水分别释放出氢气和氧气。而多数电泳仪内外液体积是不相等的,所以电极液经过多次应用后pH会改变,同时还可能引入一些杂质和未凝固的丙烯酰胺,效果会逐渐变差。
但并不需要每次更换电极液,尤其是大电泳槽,太费甘氨酸了。我曾试过每次电泳后测pH(内外液混合后),改变到一定程度后就重新配。不过这样实验平行性并不好。后来换另一种方法效果很好,向你推荐:因为内液直接接触蛋白,并且体积较小(通常是这样,伯乐应该也是吧?),而外液仅起导电作用,因此每次重新配内液,用上一次用过的电极液做下一次电泳的外液。电泳跑完后直接把内外液混合,作为下一次的外液,多余的(相当于内液的量)倒掉。这样每次只需更新内液的量就可以了,比较节约,而且整个体系处于平衡状态,重复性很好。你可以试试。
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BUK[使用道具]
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这是bio-rad网站2D doctor关于竖纹的解释:
Problem:  Vertical spot streaking
Likely Cause:  
a) Equilibration time too short
b) SDS gel has wrong pH
c) SDS concentration too low in equilibration solution
Recommended Solution:  
a) Prolong equilibration steps. Recommended equilibration time is 10–15 min per equilibration step
b) Ensure that the pH of the Tris buffer used for SDS-gel casting is 8.8. The wrong pH will decrease the mobility of the protein-SDS complexes and cause vertical streaks of protein
c) Ensure that the SDS concentration is at least 2% (w/v) in the equilibration solution
^_^,我觉得平衡的问题可能更大。
BIO-RAD大槽的缓冲液用完一次,如果不是马上跑第二次,建议不要再用。因为温度高放久了会长菌,缓冲液变粘稠,跑出来的胶银染背景很高,能把蛋白点都盖过去。
如果想用第二次,建议将正负极缓冲液混均匀再用。
我用过第二次的,没有出现你上图中那样的竖纹。只是电泳时间延长了,银染背景稍微高一些。
如果是正式实验,还是建议不要用了,考虑到批间重复的问题。
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