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标题:【求助】免疫共沉淀

89tongzijun[使用道具]
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发表于 2014-5-16 11:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】免疫共沉淀

用goat来源的A分子的一抗做IP，然后将免疫沉淀物用兔来源的B分子的一抗作western以检测沉淀下来的复合物中有没有B分子，western时用的Goat 抗兔的二抗。B分子的分子量为54KD，阴性对照是用的goat 的IgG,也就是在沉淀的时侯用goat IgG代替A分子的一抗与protein G作用，其余步骤一样。用沉淀物做出的western有两个条带,分子量约为50-60之间，另一条约20多，条带很淡，而且处理组与未处理组有差异。不知50-60之间那个是不是B分子。还是抗体的条带？阴性对照的goat IgG没有条带。请高手帮忙分析一下。万分感谢！
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jujuba[使用道具]
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发表于 2014-5-16 11:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1。首先你要弄清楚你要做什么先，是检测微量A，还是检测A跟B的相互作用
2。如果你做IP的时候用goat来源的做，WB用rabbit的一抗，WB的二抗就一定要用抗rabbit的。不能用goat的。
3。按照你的做法，出现的条带是不可能是B。
4。IgG的轻重链大概就是5x和2x
5。种属来源不同的IgG是有区别的，必需要用相同种属的二抗才可能做出来。例如说鼠的IgG必需要用抗鼠的二抗，用兔的二抗检测不出来。
6。你用抗rabbit的二抗再做一次，看看条带再说
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发表于 2014-5-16 11:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

B分子的分子量为54KD，IgG的轻重链在50kd和20kd左右，而且这两条带western要出来的，所以沉淀下来目的蛋白的可能性很小。另外如果沉淀下来目的蛋白的量少，抗体敏感性再差一些，也可能引起阴性。
不知道可不可以做一个rabbit一抗的对照以明确2条带的性质？
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89tongzijun[使用道具]
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发表于 2014-5-16 11:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可能上面没说清楚，我是做蛋白A与蛋白B是否有相互作用，用羊抗A的抗体做的免疫沉淀，沉淀下来的物质用兔抗B的一抗做western检测B, western用的二抗是羊抗兔的，也就是针对B一抗的二抗。做出来的带很微弱，有两条，约50-60，20-30。这两条带在阴性对照没有，而且在不同的实验组强弱有差异。我想知道50-60这条带是我的目的条带还是抗体条带啊？另外，我用同一张膜洗膜后不加一抗，直接加兔抗羊的二抗，做出了二条很明显的抗体重链和轻链的条带，阴性对照的也有。请帮忙分析一下啊！
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发表于 2014-5-16 11:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


你在作免疫沉淀的时候，是用protein G的agarose作为沉淀的二抗吗，如果是这样，你膜上肯定会有杂带的，是由于你的Western的一抗与膜上的Protein G结合，导致的，我做过验证实验的。
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发表于 2014-5-16 11:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

“你用同一张膜洗膜后不加一抗，直接加兔抗羊的二抗，做出了二条很明显的抗体重链和轻链的条带，阴性对照的也有。” 这个结果是肯定的，因为不管你是阳性还是阴性对照，里面肯定是都会含有羊IgG的，你用兔抗羊二抗检测，肯定会有条带出来的。如果你是用Protein G来作沉淀的二抗的话且直接用上样缓冲液对沉淀进行处理，并上样电泳的话，我怀疑你的二十多Kd的那条带有可能是由于你的Western的一抗与膜上的Protein G结合而导致的，Protein G的分子量在30Kd左右，另外由于你的目的蛋白的分子量为54Kd，很难和重链分的清楚。建议你用个试剂盒是一下，国外有专门针对IP WB的试剂盒，可以很好的屏蔽掉你不想要的条带，只让你的目的蛋白显带，而且也可以去除掉Protein G的干扰。我用过这个试剂盒，效果还不错。给你推荐一下。One-Step IP-Western Kit，专门用于免疫沉淀后的WB检测。
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 小中大

我的确是用protein G沉淀的，可能20-30KD那条带是protein G的，很弱。但另一条带是不是我的目的条带啊。用羊的一抗沉淀，兔的 一抗做western, 二抗用的羊抗兔，按理说是不会出现抗体重链的啊
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发表于 2014-5-16 11:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

上面高手的发言都很有道理。不过，我觉得有50KD左右的有可能是的，因为楼主用同一张膜洗膜后不加一抗，直接加兔抗羊的二抗，做出了二条很明显的抗体重链和轻链的条带，阴性对照的也有。但是当用兔抗B分子的一抗，Goat 抗兔的二抗作western时，阴性对照的没有条带。
因为楼主是想看A和B是否有相互作用，建议楼主：
1，如果有条件就反过来做一下，先用抗B的抗体把包含B的复合物抓下来，再做WB检测是否其中有A。
2，IP离心收集复合物后的上清，处理后做WB，检测其中的A和B含量在对照和处理组中是否有差异，可以辅助判断一下。
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 小中大
我的确是用protein G沉淀的，可能20-30KD那条带是protein G的，很弱。但另一条带是不是我的目的条带啊。用羊的一抗沉淀，兔的 一抗做western, 二抗用的羊抗兔，按理说是不会出现抗体重链的啊

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理论上是不会出现重链了，那条带应该就是你的目的蛋白的条带。另外楼上说得也很有道理，你可以反过来做一下，A的分子量是多少，只要不是50KD或20KD，问题就简单了。
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89tongzijun[使用道具]
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 小中大

谢谢各位的指点，我已订购了用于做IP的B的抗体，准备用B抗体作沉淀，A抗体做western,从另一方面进行验证。谢谢啊！
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