【求助】原核表达时尿素不能溶解包涵体是怎么回事啊？

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标题:【求助】原核表达时尿素不能溶解包涵体是怎么回事啊？

花想容[使用道具]
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发表于 2014-5-16 15:04 资料个人空间短消息加为好友

小中大

原核表达是bufferB不能溶解包涵体是怎么回事啊？ BufferB是含有8M尿素的缓冲液，非常奇怪，以前从来没有遇到过。而且最近表达的两个蛋白都是这样，但是就是找不到原因。
注：溶解前已经反复冻融数次，并且超声破碎过了。
请大家给点意见和建议，谢谢。

yjf1026[使用道具]
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发表于 2014-5-16 15:04 资料个人空间短消息加为好友

小中大

有两个原因可以影响尿素溶解包含体。
第一是温度：buffer得温度越高越容易溶解，而温度太低不利于溶解，建议升高温度。
第二是PH，PH越高越容易溶解，低于7，效果会差很多，建议ph升到8或者以上。
如果这样都做了仍然不行，
可以给你一个窍门，就是用尿素悬浮了包含体之后，去超声，这样超几十次，一般都会彻底溶解了，注意超声时，不要放在冰上，就是让温度升高。

ending[使用道具]
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发表于 2014-5-16 15:05 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 yjf1026 于 2014-5-16 15:04 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

有两个原因可以影响尿素溶解包含体。
第一是温度：buffer得温度越高越容易溶解，而温度太低不利于溶解，建议升高温度。
第二是PH，PH越高越容易溶解，低于7，效果会差很多，建议ph升到8或者以上。
如果这样都做了仍然不行，
可以给 ...

顶一下
可以在恒温水浴里超声溶解。不要用那种探头式超声，用water bath sonicator. 否则可能局部温度过高造成不可逆变性，影响下游操作（复性等）。

yjf1026[使用道具]
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发表于 2014-5-16 15:05 资料个人空间短消息加为好友

小中大

温度过高我倒觉得不是问题，我曾经看过一篇文献，那个作者更加牛呢，他居然让蛋白在100度十多分钟，然后在变性，我都觉得有点‘bt’，但是人家又复性成功了。当时佩服得不行。

wmp1234[使用道具]
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发表于 2014-5-16 15:05 资料个人空间短消息加为好友

小中大

但是超声温度过高不是对蛋白不好吗，表现出来的就是离心后黑色的物质较多。

花想容[使用道具]
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