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标题:【求助】蛋白表达量低怎么办？

68943512yao[使用道具]
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发表于 2014-5-16 16:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】蛋白表达量低怎么办？


马上就要毕业了，可是我的蛋白还是表达量很低怎么办？构建的克隆测序正确，载体是PQE30，表达菌是M15。表达是毒性蛋白。操作都按照PQE手册上要求。37度摇菌至OD0.6加诱导剂，37, 30, 25度诱导4 ,6, 9小时，IPTG浓度（0.5, 1, 1.5mM)均实验过。1毫升菌液溶解在100微升上样buffer取6微升上样，但是SDS-PAGE 上还是未见明显蛋白表达。westernblot检测到蛋白表达。马上要毕业了，就差最后大量表达纯化了。可是蛋白表达量依然很低，如何提高表达量呢？能否大量摇菌纯化浓缩呢？急盼高手指教！
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ritou1985[使用道具]
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发表于 2014-5-16 16:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
蛋白表达专题讨论
你这种情况，可能更换载体，未必作用很大，不过你可以试试。
不过我建议，
表达毒性蛋白的时候，你要高od，诱导，短时间收菌。
例如，在od＝1.0的时候诱导，然后1.5小时，或者更短收菌。
此外还可以考虑浓缩法培养，就是准备2.5的LB，其中两个先摇到1.0，然后离心浓缩，再用剩下的0.5L，把菌体悬浮，继续培养0.5h，然后诱导，一个小时后收菌，这样应该可以得到更多一些的蛋白。
另外如果你的蛋白在文献中有报道的，相互作用的蛋白，你可以共表达，可以抑制毒性蛋白的毒性，那样就可以得到大量的蛋白了。
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68943512yao[使用道具]
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发表于 2014-5-16 16:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你的建议对我有所启发。我的蛋白文献上还没有报道，是新蛋白。园子里有帖子说毒性蛋白可以用42度做诱导温度，不知道有没有人试过。还有，如果表达量一直不高的话能否可以摇1升的细菌然后过柱纯化完浓缩跑胶？
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ritou1985[使用道具]
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发表于 2014-5-16 16:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

摇一升的菌，一点问题都没有的，甚至可以更多呵呵。我们实验室有人摇三升，但是，不推荐，上样量大容易堵柱子。
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ritou1985[使用道具]
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发表于 2014-5-16 16:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

呵呵，不知道你们试验室的实力怎么样呵呵
给你给你介绍一种更新的方法，国内几乎还没有人做，国外已经比较多了。
cell－free，技术，简单的说就是用体外试管里将蛋白表达所要的核糖体、RNA、NTP等等都按一定比例加进去，然后就能表达出你的蛋白。
如果你的蛋白非常重要，例如像是PNAS或者CNS级别的，呵呵，可以和国外的联系。
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发表于 2014-5-16 16:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

呵呵，我们实验室哪有那么先进的设备呀。有个奇怪的现象就是我的师姐表达的蛋白和我一样。载体，细菌都一样。不同的就是她的蛋白在N端比我多了11个载体上的氨基酸。她的表达量就很高。而我用相同的条件都不行。真是搞不懂呢。
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发表于 2014-5-16 16:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这个现象是很正常的啊。
所以我给你的建议里面有更换载体一条，例如pet28表达许多蛋白效果比pet21好，就是因为pet28前面有一段his－tag。
虽然仅仅少了一段，却是不同的蛋白啊。
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发表于 2014-5-16 16:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的师姐的载体也是PQE30，表达的蛋白和我的一样。只是我的基因酶切插入位点和她的不同。老板觉得她的插入基因前面多了一些载体上的序列，所以要求我更换了酶切位点。这样his-tag完就直接是我的基因了。实验做的很郁闷呢，好不容易做western表达出来了，但是产量就是不高。所以一直在摸索表达条件。准备今天按照楼上战友高od浓缩法，42度诱导一下。
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 小中大
我用浓缩法和42度诱导，SDS-PAGE还是没有看见特异性条带。只能大量摇菌纯化了吗？怎么就是没法优化条件使表达量提高呢？
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