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标题:【求助】如何挽救实验。

12xunmei[使用道具]
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发表于 2014-5-16 17:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】如何挽救实验。


在实验过程中发现所获得的实验组织片细胞分布极不均匀，目的细胞成簇分散存在于基质细胞中，而提取的蛋白是组织中的总蛋白，且目的蛋白存在的细胞是非再生细胞，不能够培养，体外操作时间不能过长，而且标本非常稀少。比较不同组织片目的蛋白的含量出现难题，使实验陷入僵局。
可否有高手指点，这种情况下如何挽救实验，可以通过重复实验WESTERN BLOT来验证吗？有没有去除基质细胞影响的更好办法？焦急盼望答复！
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发表于 2014-5-16 17:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果明确目的蛋白仅仅在目的细胞中分布，那么增加样本后，可以默认实验组与对照组目的细胞在组织中的比例是类似的，可以提取总蛋白行western最后反映目的细胞的表达量。
免疫组化方面也可以佐证。
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发表于 2014-5-16 17:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

多谢斑竹的回答。非常感激，另外还想再请问，我在实验中发现有些组织片中根本没有目的细胞，这种细胞分布极为不均匀的组织标本，您认为样本增加至少多少合适？是实验组和对照组多个样本混合提蛋白好呢，还是随机将样本分成几组分别做提蛋白作WB，再统计分析结果好？标本收集非常困难，不知道怎么处理更合理还望指点？
另外，如果想在好一些的刊物发表文章，提总蛋白后是否还需要用WB检测目的细胞或基质细胞的特异性表达的蛋白来进一步说明组织中目的细胞的含量，相当于多一个内参，因为这个内参不好找到，所以想了解可否只通过增加样本量来解决这个问题？
再次感谢！
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发表于 2014-5-16 17:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你如何鉴定组织片中的目的细胞？光镜下看？你能否介绍一下背景知识，他为什么会不均匀？是不是有使目的细胞均匀的方法？
你也不要盲从，多听其他战友的观点，毕竟我也没有这样做过。有一点，免疫组化在国内一般杂志是认可用来定量的，国际上是不承认的。
多样本统计肯定是需要的，几个样本混合不符合实验设计的基本原理，预实验可以估测样本含量吧，western一般5个左右差不多够了，最少也要3个样本。
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发表于 2014-5-16 17:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我是通过光镜HE染色观察和胶原酶消化基质分离细胞观察到有些标本的组织片中没有目的细胞存在。这种分布类型在一些文献也报道过，因为消化标本获得的细胞量太少又无法培养，也没有办法让细胞均匀分布，才考虑用组织提总蛋白，预实验WB也检测到目的蛋白，但就是定量方面出现这样的问题不好衡量不同组织片蛋白的表达量，哪怕来源于同一个病人的不同组织片细胞分布很不相同，比较的基准就不好确定。
另外，免疫组化如果把两张片子放在一起用同一个条件做，是不是也可以做定量比较，这样国际上认可吗？
多谢赐教！
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发表于 2014-5-16 17:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
再补充说明一下实验背景，我做的是卵巢皮质活检标本，因为卵泡分布的生理特点就是成簇分布于 基质细胞中，并随年龄和个体不同差异很大。我要测的目的蛋白在卵周围的颗粒细胞表达。同一个来源的标本分成2组体外实验接触不同的干预，因为比较的本身就是同一个来源的不同标本，而不是来源于两个个体，所以想到混合2-3个来源不同个体但处理相同的标本，设计不合理的地方请多多指正，感激不尽！
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发表于 2014-5-16 17:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也遇到过这样一个问题--就是因为样本量少能否把同一组的2个样本混合起来提取蛋白--后来老板否认了这个想法。
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发表于 2014-5-16 17:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问被否定的理由是什么？我其实觉得有些情况下混合后可以消除一些个体差异带来的偏差，继续恭听各位的高见。
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发表于 2014-5-16 17:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
同一个来源的标本分成2组体外实验接触不同的干预，因为比较的本身就是同一个来源的不同标本，而不是来源于两个个体，所以想到混合2-3个来源不同个体但处理相同的标本，设计不合理的地方请多多指正，感激不尽！

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我觉得这个最好（或者必须）进行配对T检验，就是说比较同一个样本处理前后的差异。
为了排除不同个体差异的干扰提高检验效能，你应该拿一个来源的标本比较2个处理后的差异，断不可以混合不同来源的样本。
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qhyu[使用道具]
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 小中大
请问被否定的理由是什么？我其实觉得有些情况下混合后可以消除一些个体差异带来的偏差，继续恭听各位的高见。

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理由老板没有直接说，他说我在出“妖蛾子”。如链接中的战友所言，混合样本后虽然能够消除个体差异，但是使检验效能降低。最后确定有无差异要通过统计学进行的，混合后必定降低了样本量。
我在想链接中鱼苗的问题，类似的是培养细胞就是个混合物，但是培养细胞具有均质性，认为每个细胞都是一样的，而且接受相同的处理因素，所以可以混合测一瓶细胞的表达。
鱼苗是否满足这个条件呢？我想啊，是不是同一窝鱼苗具有类似的遗传背景，可以作为一个样本混合提蛋白，他可以让1窝鱼苗作为1个样本，多做几窝鱼苗是不是可以呢？
统计学对实验设计的要求是在你所说明的问题上每组中样本内部要具有均质性。
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