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标题:【求助】关于蛋白的分离纯化问题

free[使用道具]
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发表于 2014-5-16 17:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】关于蛋白的分离纯化问题


小弟前两天做了外源蛋白的表达,我的蛋白是分泌型的,我把发酵培养液在tris缓冲液中透析24小时后,就上了亲和层析柱子,由于我表达的是人VEGF,和肝素有亲和力,所以选用肝素层析柱HEPARIN SEPHAROSE 6 FAST FLOW ,我用ACTA,用0-2M NaCL梯度洗脱,出峰时明明只有一个峰,怎么跑sds-PAGE时,还是出现了很多条带.我觉得很纳闷,为什么出峰时就一个很尖的峰,而跑电泳却出现了很多条带.好奇怪,请问大侠们这该如何解释?谢谢^_^
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发表于 2014-5-16 17:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我是这样想的:第一你的蛋白可能不纯;第二:SDS-PAGE主要是检测蛋白亚基的,蛋白变性后可能解聚成多个亚基而出现多个条带,你可以用非变性电泳看看.
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发表于 2014-5-16 17:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

肝素能和抗凝血因子Ⅲ、凝血因子、蛋白合成因子、脂蛋白、干扰素、核酸结合蛋白、限制内切酶、凝血酶及类凝血酶等生物大分子结合
所以你看似洗脱出了一个峰,但其实这个峰里包含了不少的蛋白种类
想仅仅通过一步肝素亲和就得到很纯的VEGF似乎是不大现实的.
你的发酵液里面包含了很多杂蛋白,仅仅用了透析是没用的,很多杂蛋白根本透不出来.
建议先查查这个VGEF的疏水性如何,是否可以先硫酸铵沉淀一下,分掉一些杂蛋白,然后再上肝素亲和柱,然后电泳看杂带和VGEF的MW是不是差很多,如果差很多可以进一步用分子筛;如果大小差不多,那只能用离子交换来进一步精纯了
希望这些对你有所帮助
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发表于 2014-5-16 18:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

多谢各位大侠.我的蛋白没有组氨酸标签的
我的蛋白是VEGF165
我看到资料是用Heparin Sepharose CL6B纯化的,透析后立刻过柱就能得到纯品,而我的柱子是Heparin Sepharose 6 fast flow ,请问这两种柱子有什么区别吗?我的VEGF165是否能用这种柱子纯化?
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tangxin_80[使用道具]
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发表于 2014-5-16 18:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1.　Heparin Sepharose CL6B与Heparin Sepharose 6 fast flow 区别不大，Heparin Sepharose 6 fast flow 更耐压力；
2.　你洗脱时盐的浓度是不是升得太快了，本该分开的峰现在成了一个峰。
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发表于 2014-5-16 18:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1.　Heparin Sepharose CL6B与Heparin Sepharose 6 fast flow 区别不大，Heparin Sepharose 6 fast flow 更耐压力；

2.　你洗脱时盐的浓度是不是升得太快了，本该分开的峰现在成了一个峰。
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发表于 2014-5-16 18:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

i: 一个峰有很多杂蛋白很常见,因为性质总有些类似.
ii: 将洗脱梯度放缓可能有效
iii: 酵母表达出来的其他蛋白可能会跟肝素柱结合, 你的目标蛋白降解产物也会跟肝素结合.
iv: 永远不要指望一个柱子可以将蛋白质纯化的很纯.
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发表于 2014-5-16 18:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

建议洗脱的时候分不同浓度的盐做阶段洗脱,找到合适的浓度洗脱目标蛋白同时能把杂质分开,肝素本身也有离子作用,所以你需要找合适的起始浓度,避免因别的作用力干扰才有得到纯品的可能.
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 小中大
我也觉得有可能洗脱时盐的浓度升的太快了,所以导致虽然出了一个峰,但是跑电泳却跑出来很多条带.另外我用的是trishcl(ph8.0),不知道这个缓冲液,有没有问题??
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 小中大
请问楼上站友的方法,和我的线型梯度洗脱有什么不同吗?找到合适的起始浓度是什么意思啊?
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