蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】蛋白表达求助

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】蛋白表达求助

dongdongqiang[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 79825
精华 1
积分 473
帖子 601
信誉分 102
可用分 3821
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-12-16
状态 离线
1

发表于 2014-5-17 16:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】蛋白表达求助


请教各位XDJMs
最近做表达，每次都会死掉，而且都是在加入IPTG诱导以后，第二个小时出现。也就是说第一个小时还长得好好的，第二个小时开始就死的很惨，通常是从1.4左右直接到0.4左右，连续几次都是这样，我怎么想都想不通，实在太痛苦了。也到这里查过以前的帖子，但还是困惑，请教各位高手指点一下吧，不胜感激。3X
顶部
DONT[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 73548
精华 0
积分 449
帖子 557
信誉分 100
可用分 3626
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-24
状态 离线
2

发表于 2014-5-17 16:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你加多浓的IPTG?
表达的蛋白对细菌有没有毒性？
顶部
dongdongqiang[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 79825
精华 1
积分 473
帖子 601
信誉分 102
可用分 3821
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-12-16
状态 离线
3

发表于 2014-5-17 16:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

IPTG是1M分别试了120uL和150uL,，用的是pGEX, BL21,蛋白应该没有毒性.因为以前实验室也有人表达成功过的，另外我是加了IPTG以后降温到30度。而且当OD降到0.4以后，我索性不管它，继续摇，就基本没有变化了。到底是什么原因呢？
顶部
小野花[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76741
精华 1
积分 299
帖子 293
信誉分 102
可用分 2211
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-9
状态 离线
4

发表于 2014-5-17 16:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

分析可能有两个原因。
第一，就是你得蛋白有毒性，诱导后使菌死掉。
对策：1，更换一下菌株，对于有毒性得蛋白，你可以尝试一下BL21（plys），或许会有效果。
2， 在od＝1得时候诱导，诱导后一个小时内收菌。
第二，可能存在噬菌体。你仔细看看od降到0.4之后是不是有些悬浮得小得白色、絮状得东东，如果有基本就是噬菌体。如果是，我们可以继续讨论呵呵。
顶部
dongdongqiang[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 79825
精华 1
积分 473
帖子 601
信誉分 102
可用分 3821
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-12-16
状态 离线
5

发表于 2014-5-17 16:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

非常感谢大家的意见。如果蛋白有毒性，可是之前我们实验室也有人用相同的方法表达过，没有这种情况。
od降到0.4以后，菌液变的澄清，有好多白沫沫，有时候也有白色絮状东东。还有一点，我这次是用两个锥形瓶 overnight, 从同一个plate上各挑选了一个单菌，结果第二天发现有一瓶里面有好多悬浮的白色絮状dd，另一瓶是好的。所以就选了好的那一瓶inoculat。这会是一个问题么？
顶部
gogo[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77052
精华 0
积分 821
帖子 1341
信誉分 100
可用分 7487
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-12
状态 离线
6

发表于 2014-5-17 16:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不一定是噬菌体.
可能是你的IPTG有问题或别的试剂.
你可以换用别人配的或别的公司的试试
顶部
小野花[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76741
精华 1
积分 299
帖子 293
信誉分 102
可用分 2211
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-9
状态 离线
7

发表于 2014-5-17 16:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 dongdongqiang 于 2014-5-17 16:20 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

非常感谢大家的意见。如果蛋白有毒性，可是之前我们实验室也有人用相同的方法表达过，没有这种情况。
od降到0.4以后，菌液变的澄清，有好多白沫沫，有时候也有白色絮状东东。还有一点，我这次是用两个锥形瓶 overnight, 从同一 ...

相关疾病：
感染

很抱歉，你的现象，非常非常有可能是噬菌体。
噬菌体是一个非常麻烦的事情。尤其在培养细菌比较多的涉及基因工程的实验室。
你的现象非常象，很可能是感染了噬菌体。
有两种方法
一种就是筛选抗噬菌体的表达菌株，国内文献很多这方面的文章，但是我不推荐。
第二种就是彻底杀菌消毒。如果你确定了是噬菌体，可以详细讨论。
可以参考下面两帖。
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/6792098_1.html')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/6797999_1.html')
顶部
wood533[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76132
精华 0
积分 863
帖子 1385
信誉分 100
可用分 7745
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-1
状态 离线
8

发表于 2014-5-17 16:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我们也碰到了这样的情况，基本上就是噬菌体，检查一下来源
顶部
vivian4123[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 75243
精华 0
积分 417
帖子 494
信誉分 100
可用分 3331
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
9

发表于 2014-5-17 16:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


相关疾病：
痛风
其实出现噬菌体，真是是偶然现象。就像老鼠多的地方容易出现蛇一样呵呵。
既然你已经确定了是噬菌体。可以给你一些方法参考
1、摇床停止摇菌，放到室外，如果不方便，至少是通风的地方，在太阳下晒两天到三天，一是为了通风，二是，杀菌，如果彻底的没有菌了，噬菌体会很快饿死，所以紫外也是可以的。
2、最好，更换一批用具。例如你的封口用的铝箔，三角瓶。
3、离心机，超净台彻底杀菌。
至少保证要三天之内不要养菌了。第一条是最重要的，切忌出现噬菌体之后继续摇菌，非常容易扩散到其他人的。
顶部
dongdongqiang[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 79825
精华 1
积分 473
帖子 601
信誉分 102
可用分 3821
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-12-16
状态 离线
10

发表于 2014-5-17 16:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
很感谢大家的意见，我们已经和老板讲过了，决定对摇床还有冰箱做清理，可是我还是想不通，我们实验室没有人做噬菌体相关的东西，到底是怎么感染的呢？如果真的是噬菌体，从前面的文章中也看到，好像很难除掉的说，那么该怎样彻底祛除呢？用bleach么？紫外灯可以吗？
顶部