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标题:【求助】Ni柱纯化问题

jujuba[使用道具]
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发表于 2014-5-17 16:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】Ni柱纯化问题


我的目的蛋白加了His-Tag，粗酶液过Ni柱后不能完全纯化，目的蛋白上面仍有一些较大的杂蛋白，请问这是怎么回事啊？为什么这些分子量较大的杂蛋白会被挂住并同目的蛋白一起洗下来啊？急啊！
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tuuu2[使用道具]
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发表于 2014-5-17 16:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这是因为你的蛋白可能和其他蛋白一起相互作用了。
一般来说buffer中加入300mM的Nacl是可以将因为离子相互作用的蛋白分开的。
你可以考虑升高盐的浓度，例如0.5MNacl.
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plaa[使用道具]
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发表于 2014-5-17 16:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
此外改用不同浓度的咪唑做阶段洗脱,这样也许能分的更好,加300mM的Nacl主要是为降低因离子作用的非特异吸附,此外不少蛋白中也有组氨酸残基,也可能会被吸附,因此想要做的比较好,需要仔细摸索条件,试剂盒或者说明书的例子只能参考.
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IAM007[使用道具]
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发表于 2014-5-17 16:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可能是蛋白质折叠过程中帮助折叠的分子伴侣类，一般在70Kda左右有出现
某些情况下不一定能够光由Ni亲和纯化完全
则需要再过离子交换
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hustwb[使用道具]
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发表于 2014-5-17 16:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

过NI柱前若是包涵体可用曲拉通洗两遍，我纯化的几个蛋白洗后已经可以达到90%左右的纯度
his-tag只是一种标签，不排除其他杂蛋白也有his残基，并可能会和Ni柱结合。
如楼上建议的那样过柱时可以多用几个咪唑的梯度洗脱，杂蛋白和目的蛋白与ni柱结合力不同的话 就有可能分开
再不能分离可以考虑用其他的分离方法
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tuuu2[使用道具]
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发表于 2014-5-17 16:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

sorry，是0.5M，也就是500mM
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gogo[使用道具]
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发表于 2014-5-17 16:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你确定是杂蛋白?
是不是有可能是聚体
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