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标题:【求助】NATURE MEDICINE: 利用蛋白组技术发现糖尿病眼底病变...

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发表于 2014-5-17 17:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】NATURE MEDICINE: 利用蛋白组技术发现糖尿病眼底病变...


News and Views:
A prize catch for diabetic retinopathy Nature Medicine - 13, 131 - 132 (2007)
Article:
Extracellular carbonic anhydrase mediates hemorrhagic retinal and cerebral vascular permeability through prekallikrein activation Nature Medicine - 13, 181 - 188 (2007)
ABSTRACT:
Excessive retinal vascular permeability contributes to the pathogenesis of proliferative diabetic retinopathy and diabetic macular edema, leading causes of vision loss in working-age adults. Using mass spectroscopy–based proteomics, we detected 117 proteins in human vitreous and elevated levels of extracellular carbonic anhydrase-I (CA-I) in vitreous from individuals with diabetic retinopathy, suggesting that retinal hemorrhage and erythrocyte lysis contribute to the diabetic vitreous proteome. Intravitreous injection of CA-I in rats increased retinal vessel leakage and caused intraretinal edema. CA-I–induced alkalinization of vitreous increased kallikrein activity and its generation of factor XIIa, revealing a new pathway for contact system activation. CA-I–induced retinal edema was decreased by complement 1 inhibitor, neutralizing antibody to prekallikrein and bradykinin receptor antagonism. Subdural infusion of CA-I in rats induced cerebral vascular permeability, suggesting that extracellular CA-I could have broad relevance to neurovascular edema. Inhibition of extracellular CA-I and kallikrein-mediated innate inflammation could provide new therapeutic opportunities for the treatment of hemorrhage-induced retinal and cerebral edema.
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发表于 2014-5-17 18:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这个研究是我们实验室做的。之所以推荐我们这项研究是我觉得我们的研究思路比较好，我们用蛋白质组技术研究12个病人眼睛玻璃体标本，找到27种差异蛋白，挑出一些蛋白进行功能研究。这篇文章是这些蛋白变化比较大的蛋白之一。
我认为蛋白质组技术关键应用还是在找差异蛋白方面。单纯作profiling似乎很难找到有意思的东西。
原因之二是我们的几年的蛋白质组研究经验表明，2D Gel技术在找差异蛋白的研究方面并不好。主要原因是一个点多个蛋白，和一个蛋白多个点。工作量大是另外的一个原因。
我们用1D Gel +LC-MS/MS发现蛋白比用2D Gel多的多,而且省时省力. 所以我推荐1D + LC/MS/MS 的研究方法.
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发表于 2014-5-17 18:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问楼主一作几个问题,
1.你们当初做过2D Gel的方法吗? 或者还试过dige等方法? 和后面的western结果比较效果怎么样?
1D+同位素标记的方法也许比你们根据unique peptide的数目定量要更加准确,为什么没有选用?
2.你们鉴定蛋白质后,选择了多少个蛋白质去做western验证和后面的功能分析,才筛选出ca-1? 通过western评价后的,你们的非标定量方法准确性怎么样?
选择ca-1做功能分析,是否主要是根据背景知识的积累?
多谢指点.
p.s 下周的实验室Journal club就准备讲您的大作
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发表于 2014-5-17 18:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
还有点问题,
1.怎么判断ca-1的产生是因还是果,即ca-1是血管渗透性增加的结果还是血管渗透性增加的原因?
2.过于这个课题,你们下一步的研究计划是什么? 继续做鉴定到的其他差异蛋白质的功能?
3.您paper在review时reviewer都提了哪些方面的意见? 您觉得您的paper在哪些方面还有缺陷?
对您的文章很感兴趣,所以问题很多,谢谢!
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发表于 2014-5-17 18:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1.你们当初做过2D Gel的方法吗? 或者还试过dige等方法? 和后面的western结果比较效果怎么样?
我们一开始做过几个样品的2D Gel, 但因为得到human vitreous样品量较少，50ul的样品只能发现很少的点。日本有个实验室也作human vitreous 蛋白质组，他们报告1D Gel比2D Gel可以发现更多的蛋白。
我们没有试过DIGE，原因是样品少，而且我们需要多组比较。
我们做过几个用2D Gel-LC/MS/MS的研究,没有一个研究最后发表论文.我们现在完全放弃这方法了.我们觉得2D的最大缺点是一个点对应多个蛋白,一个蛋白可以多个点的问题以及工作量太大.
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 小中大
1D+同位素标记的方法也许比你们根据unique peptide的数目定量要更加准确,为什么没有选用?
费用高，试验方法复杂，只能做paired比较，ITRAQ可以比较多组,但需要特定的质谱仪,而且似乎也不适合临床标本.我觉得同位素标记更适合细胞,动物标本可以严格控制的标本.uniqe peptide做定量只是最粗糟的方法,在随后的几个研究中我们用total peptide hits, peak area和total iron intensity做定量更准确些.
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发表于 2014-5-17 18:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
2.你们鉴定蛋白质后,选择了多少个蛋白质去做western验证和后面的功能分析,才筛选出ca-1? 通过western评价后的,你们的非标定量方法准确性怎么样?
选择ca-1做功能分析,是否主要是根据背景知识的积累?
我们做过10多个蛋白Western, 和MS peptide count相关性挺好,基本可以做初步筛选的指标.
我们找到差异蛋白后,是需要读所有差异蛋白相关文章, 我们注射几种蛋白作深入研究, CA-I只是其中的一个, 有的蛋白也没有发现阳性结果. 另一个原因是CA-1,Factor XII变化最大,也是选CA-1的原因之一.
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 小中大
1.怎么判断ca-1的产生是因还是果,即ca-1是血管渗透性增加的结果还是血管渗透性增加的原因?
我们没有试验证明这个问题,但我认为CA-I不是糖尿病眼底首发因素,只是出血后释放出来加重眼底病变.
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 小中大
2.过于这个课题,你们下一步的研究计划是什么? 继续做鉴定到的其他差异蛋白质的功能?
关于human vitreous的蛋白质组研究我们还在继续,主要集中在bioinformatics分析方面,我们得到了更多样品,用2种search engine检索,发现了更多的蛋白质,用total peptide hits做半定量,做go term分析, pathway分析,蛋白修饰分析,论文在准备中.
差异蛋白的功能研究在继续. 主要是眼科研究所的人在做,其中一个蛋白的研究快结束了.
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3.您paper在review时reviewer都提了哪些方面的意见? 您觉得您的paper在哪些方面还有缺陷?
这篇文章我们前后修了6-8稿, 主要的问题关于CA-I作用机制, 他们需要详细的CA-I引起Kallikrein系统激活机制.
一篇文章不可能把所有的机制都搞明白,我们还在继续这个课题.
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