【求助】蛋白过柱后不挂柱,请指教

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标题:【求助】蛋白过柱后不挂柱,请指教

summerxx[使用道具]
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发表于 2014-5-20 09:05 资料个人空间短消息加为好友

小中大

各位大侠好,
我一直在做蛋白表达和纯化,表达主要是以可溶性蛋白为主,表达量比较高,蛋白有6个组氨酸的标签,所用载体pet-cks
最近我想用HIS-TRAP亲和层析法（用的是Amersham的HisTrap HP 5ml的亲和层析柱）,蛋白缓冲液为PBS缓冲液,含2%SDS,用Bind Buffer平衡(20mM磷酸盐缓冲液,0.5MNacl,20mMimdazole),上样,洗脱(20mM磷酸盐缓冲液,0.5MNacl,500mMimdazole),然后收集各管跑了个SDS-PAGE电泳,发现我的蛋白没有挂柱,
为什么挂不上柱子？主要考虑哪些方面的原因呢? 我现在在这一步停止做不下去了,老板的意思是实在没办法用S柱和Q柱纯化,因为我马上要毕业了,现在急的要死,恳请指教！

remenb[使用道具]
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发表于 2014-5-20 09:06 资料个人空间短消息加为好友

小中大

个人建议把BIND BUFFER中的咪唑去掉，看看如何？

7437654[使用道具]
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发表于 2014-5-20 09:07 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我们也碰见过这个问题，最后分析可能是由于表达的蛋白过大，并且由于是原核表达会出现非常规的折叠所以会把His尾包含在蛋白内部不能充分暴露出来，我们的经验好像大概大于1Kb的片段就比较难于挂上柱子。

summerxx[使用道具]
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发表于 2014-5-20 09:08 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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原帖由 7437654 于 2014-5-20 09:07 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我们也碰见过这个问题，最后分析可能是由于表达的蛋白过大，并且由于是原核表达会出现非常规的折叠所以会把His尾包含在蛋白内部不能充分暴露出来，我们的经验好像大概大于1Kb的片段就比较难于挂上柱子。 ...

谢谢,我的原核蛋白表达量的确是超量表达, 有什么好建议吗?你们遇到时是如何处理的呢?能否告诉你们的处理方法吗?

summerxx[使用道具]
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发表于 2014-5-20 09:08 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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原帖由 remenb 于 2014-5-20 09:06 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

个人建议把BIND BUFFER中的咪唑去掉，看看如何？

谢谢,不过我试过不用BING-Buffer ,直接用20mMPBS来代替,结果还是不行,蛋白没有结合到柱子上

plaa[使用道具]
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发表于 2014-5-20 09:08 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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原帖由 summerxx 于 2014-5-20 09:05 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

各位大侠好,
我一直在做蛋白表达和纯化,表达主要是以可溶性蛋白为主,表达量比较高,蛋白有6个组氨酸的标签,所用载体pet-cks
最近我想用HIS-TRAP亲和层析法（用的是Amersham的HisTrap HP 5ml的亲和层析柱）,蛋白缓冲液为P ...

不知道你是如何提取你的可溶性蛋白。
建议你把上样液再用25000g离心20min，如果蛋白在上清，可能是his屏蔽；如果在沉淀中，则为非可溶蛋白。

bring[使用道具]
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发表于 2014-5-20 09:09 资料个人空间短消息加为好友

小中大

不挂住的原因可能很多
1，是否变性充分，可以改用盐酸胍，或50度水域煮半小时，然后上样
2，上样流速是否过快，可以循环过柱
3，样品体系中咪唑、盐浓度是否过高，可以不加咪唑
4，选用配基密度大的凝胶柱
5，pH是否合适，变性蛋白可以在比较高的pH下纯化，pH8.5-9.5
6，是否过载，一般来说估算一下就可以判断

summerxx[使用道具]
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发表于 2014-5-20 09:09 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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原帖由 plaa 于 2014-5-20 09:08 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

不知道你是如何提取你的可溶性蛋白。
建议你把上样液再用25000g离心20min，如果蛋白在上清，可能是his屏蔽；如果在沉淀中，则为非可溶蛋白。

谢谢,我的提取方式为直接冰浴超声破碎,然后离心 13000rpm 离心30分钟,取上清,
蛋白主要是以可溶的形式表达,我刚刚做了一个抗6-Histag的 Western-blot,也没有结果 ,
不知道你说的his屏蔽,应该如何处理啊? 多谢赐教

summerxx[使用道具]
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发表于 2014-5-20 09:10 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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原帖由 bring 于 2014-5-20 09:09 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

不挂住的原因可能很多
1，是否变性充分，可以改用盐酸胍，或50度水域煮半小时，然后上样
2，上样流速是否过快，可以循环过柱
3，样品体系中咪唑、盐浓度是否过高，可以不加咪唑
4，选用配基密度大的凝胶柱
5，pH是否合适，变性蛋白可以在 ...

非常感谢,我再改变条件进行尝试一下,谢谢你的建议

ladyhuahua[使用道具]
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发表于 2014-5-20 09:10 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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你的蛋白缓冲液里还有SDS，SDS带有负电荷，在如此高浓度的SDS中，SDS会与Ni2+结合，封闭了组氨酸和Ni的亲和空间，你的蛋白怎么能与Ni柱纯化呢？你的蛋白缓冲液能不含SDS么？如果去除SDS，你的蛋白不溶的话，你可以用8M脲或6MGuHCl溶解你的蛋白再上Ni柱看看能不能挂上

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