【求助】酶切没结果，但ＰＣＲ有结果？

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标题:【求助】酶切没结果，但ＰＣＲ有结果？

大白菜[使用道具]
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发表于 2014-5-20 09:11 资料个人空间短消息加为好友

小中大

各位老师，我将目的片段转到载体上后，双酶切没有结果，但是ＰＣＲ有结果，这是什么问题呢？
在转化克隆载体，提质粒，酶切有结果，然后回收纯化目的片段，连到表达载体上就出现了上述问题！

nn255[使用道具]
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发表于 2014-5-20 09:12 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 大白菜 于 2014-5-20 09:11 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
各位老师，我将目的片段转到载体上后，双酶切没有结果，但是ＰＣＲ有结果，这是什么问题呢？
在转化克隆载体，提质粒，酶切有结果，然后回收纯化目的片段，连到表达载体上就出现了上述问题！ ...

测序，最准确。

ending[使用道具]
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发表于 2014-5-20 09:12 资料个人空间短消息加为好友

小中大

可能是质粒提取的不纯，混有酶抑制剂，重新摇菌提质粒看看。特别是碱裂解法提质粒，容易造成质粒变性，变性的质粒能够抵抗酶切。

ritou1985[使用道具]
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发表于 2014-5-20 09:13 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我不知道你是不是用N、c两端都是自己的引物啊。
建议你用自身的引物，和载体的引物。因为即使是DNA片断也会出现小概率的转染的。
同意楼上的，测许最准确，酶切的时候出现问题的可能性比较大，例如质粒是不是提出来了，酶是不是失活了。

大白菜[使用道具]
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发表于 2014-5-20 09:13 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 ending 于 2014-5-20 09:12 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
可能是质粒提取的不纯，混有酶抑制剂，重新摇菌提质粒看看。特别是碱裂解法提质粒，容易造成质粒变性，变性的质粒能够抵抗酶切。

碱法会造成质粒变性！？那有什么办法能避免吗？
对了，提质粒后加RNA酶消化会不会影响随后的酶切反应呢？！

大白菜[使用道具]
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发表于 2014-5-20 09:13 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 ritou1985 于 2014-5-20 09:13 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我不知道你是不是用N、c两端都是自己的引物啊。
建议你用自身的引物，和载体的引物。因为即使是DNA片断也会出现小概率的转染的。
同意楼上的，测许最准确，酶切的时候出现问题的可能性比较大，例如质粒是不是提出来了，酶是不 ...

N,C端都是自己的引物啊，载体的引物是？有点迷糊啊，我刚接触分子生物学实验，好多都不懂，真是感谢各位帮我解答问题！

hold住[使用道具]
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发表于 2014-5-20 09:14 资料个人空间短消息加为好友

小中大

碱裂解法提取质粒,在离心后的步骤中如果没把液体倾倒干净,双酶切就切不开.这样的话只要用乙醇沉淀DNA再用氯仿抽屉就可以了.

plaa[使用道具]
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发表于 2014-5-20 09:14 资料个人空间短消息加为好友

小中大

阳性鉴定的可靠度为：
PCR<酶切<测序
在筛选中pcr假阳性还挺高的
对双酶切来说
一般限制酶切只会是酶切不完全，但不至于什么都没切出来。况且如果没切开的话从电泳图上也能看出来。你注意观察你的载体是单条带还是多条带，如果是后者，那就是超螺旋，还有没切开的。

cwcwcww[使用道具]
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发表于 2014-5-20 09:15 资料个人空间短消息加为好友

小中大

PCR做了对照没有?
很多因素会影响酶切的效率和结果的,而且还有质粒抽提本身的因素,建议做双酶切的同时做两个单酶切确定是不是自己要的阳性克隆和酶切效率,酶切时间最好也加入考虑范围.
希望一切顺利!