蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】用牛血清白蛋白如何配WB封闭液？

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】用牛血清白蛋白如何配WB封闭液？

wawa[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 71235
精华 0
积分 440
帖子 560
信誉分 100
可用分 3618
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-23
状态 离线
1

发表于 2014-5-20 09:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】用牛血清白蛋白如何配WB封闭液？

做WB总是出现非特异性背景，用牛血清白蛋白是否可以降低背景，该如何配封闭液，还要加奶粉或者别的试剂吗？
顶部
wawa[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 71235
精华 0
积分 440
帖子 560
信誉分 100
可用分 3618
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-23
状态 离线
2

发表于 2014-5-20 09:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

是总出现非特异条带
顶部
ero11[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75131
精华 0
积分 684
帖子 1028
信誉分 100
可用分 5953
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-19
状态 离线
3

发表于 2014-5-20 09:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我们都是用5%脱脂牛奶封闭的.效果还可以.而且一抗二抗也是溶解在牛奶里.
配方是:5g脱脂奶粉/100mlTBST.
顶部
yonger[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 74174
精华 0
积分 572
帖子 803
信誉分 100
可用分 4861
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-7
状态 离线
4

发表于 2014-5-20 09:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

用牛奶封闭背景肯定比BSA干净得多，因为牛奶中蛋白种类更丰富，更有利于封闭，你说背景深可能是封闭或洗涤条件没摸好，我们的封闭条件：
5%牛奶 in PBS 4度封闭过夜，特别注意封闭时间要足够长，我们做过37度封闭2个小时效果都没4度过夜好，所以强烈推荐4度过夜
一抗和二抗在2.5%牛奶 in PBS（in PBST中亦可，但是要注意TWeen得量）中孵育。
除了封闭洗涤也是很关键，一般来说只要是特异结合是不容易洗掉的，我们一般一抗用PBST（0.05%-0.1%）洗六次，每次5min，脱色摇床上充分震荡
二抗用PBST（0.05%-0.1%）洗6次，再用PBS洗两次，同上
顶部
8princess8[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75310
精华 1
积分 664
帖子 821
信誉分 103
可用分 5056
专家分 20
阅读权限 255
注册 2011-10-21
状态 离线
5

发表于 2014-5-20 09:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
出现非特异性背景一般不是blocking的问题, 5%milk, 3%BSA室温一小时效果差不多.应该检测一抗二抗浓度是否过高,另外可增加洗涤次数,时间,TBS可加1%Tween20.
除非是磷酸化的抗体最好用BSA.
Block the membrane in 5% w/v BSA (fractionV) NOT MILK (milk contains casein which is a phosphoprotein; This is why it causes high background because the phospho-specific antibody detects the casein present in the milk).
顶部
vvmmoy[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79224
精华 0
积分 825
帖子 1270
信誉分 100
可用分 7255
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-8
状态 离线
6

发表于 2014-5-20 09:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我用5％ bsa（in TBS）室温1h，做pERK实验挺好的，供参考。注意用TBS溶BSA，比TBST（TBS＋0.1% Tween）封闭效果好。
顶部
zsxan1990[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76272
精华 0
积分 442
帖子 604
信誉分 100
可用分 3776
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-3
状态 离线
7

发表于 2014-5-20 09:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

注意封闭用的BSA不是全BSA蛋白,而是BSA Fraction V.
不过如果你的一抗是单抗,推荐使用脱脂奶粉封闭,因为这个封闭效果比BSA效果好.
顶部
qianqin1977[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 75849
精华 0
积分 370
帖子 460
信誉分 100
可用分 3076
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-28
状态 离线
8

发表于 2014-5-20 09:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
在western blotting中，蛋白提取试剂RIPA buffer 蛋白裂解液中的去氧胆酸钠的作用是什么？如果没有去氧胆酸钠，是否可以？多谢！！
顶部
u234[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77031
精华 0
积分 691
帖子 1081
信誉分 100
可用分 6196
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-12
状态 离线
9

发表于 2014-5-20 09:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你做p-erk 上样量是多少啊？我用的是cell signal的抗体上样量要求比较大60－80ug，做的效果还不好呢！能指教一下是怎么回事吗？
顶部
wmp1234[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79925
精华 0
积分 588
帖子 855
信誉分 100
可用分 5078
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-17
状态 离线
10

发表于 2014-5-20 09:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不好意思回家过年了。我用的是santa－cruz的pERK抗体（1：500），cos-7,12孔板（70－80汇合度，～4×10e5 cells/well）每孔加150ul裂解液裂细胞，离心后取120ul上清加30ul 5×loading，60ul上样，你自己算算大概多少吧。
顶部