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标题:【求助】切胶免疫高手请看过来!

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1
 

【求助】切胶免疫高手请看过来!


各位高手:
我想用SDS-PAGE电泳的胶切下目的条带来免疫动物.有如下几个问题请教:
1 切下的胶 在室温下经过考染 高脱 低脱是否可以?
2 经过上述处理的胶再放入-20中保存可以吗?能保存多长时间?
3 直接将胶条与免疫佐剂融合还是将胶条融化以后再融合呢?
请高手指点!
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wood533[使用道具]
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1。最好不要用考染。用KCl染色。考染打兔子会把兔子打死的。
2。KCl染色后把胶切下,最好马上取免疫兔子,放-20也行,估计半年没啥问题。
3。切下的新鲜胶条不用和免疫佐剂混合,因为丙稀胶可以起到和佐剂一样的作用。用组织研磨器冰浴研磨,加生理盐水,最好是能用5号注射针头过一过,保证胶可以研磨均匀。
从我的经验,最主要是一要保证切胶的准确,尽量减少杂蛋白。二是要控制好每次注射的蛋白量,少了抗体产生的少,多了容易致死动物。
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yysr238[使用道具]
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cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=8135322&sty=1')
看看这个帖子,介绍一种kcl染色液,切胶后要等蛋白浸出后再免疫
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orangecake[使用道具]
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我的具体做法是切下考染的胶条(考染的胶不会致死兔子),用组织研磨器研碎,然后过几次2ml的注射器针头,以保证在免疫时凝胶颗粒不会堵塞针头。切下的胶存放-20度几个月应该没问题,你不放心的话,也可现免疫现制备胶。我是将胶研碎后与佐剂混匀的。
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wood533[使用道具]
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5
 

关于佐剂的问题,你需要和制备抗血清的地方联系,我是在遗传所做的兔血清,他们就不需要加佐剂。做的还可以,效价可达10000。不过还是那句话,方法没有一成不变的,只要做出来就是王道(引用某牛人)。^_^。
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各位高手:
大家的意见真的很好!我再谈谈我的实验问题:
1、用考染的话,蛋白在胶中,那么在室温很长时间,对蛋白会不会有影响?
2、我试过用0.25mMKCL,不含有其他成分,但是目的条带显的不明显。
3、我们没有组织研磨器,用研钵加少许生理盐水可以吗?
4、有人说配胶的时候可以在浓缩胶时不插梳子,可以上样1毫升,但是不插梳子怎么上样啊?
请大家多多指教!
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QUOTE:
原帖由 @STAR@ 于 2014-5-20 09:51 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

各位高手:
大家的意见真的很好!我再谈谈我的实验问题:
1、用考染的话,蛋白在胶中,那么在室温很长时间,对蛋白会不会有影响?
2、我试过用0.25mMKCL,不含有其他成分,但是目的条带显的不明显。
3、我们没有组织研磨器,用研钵加少 ...

1.染色液的配方请见cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=8135322&sty=1'),经验所得,可以借鉴。
2.不插梳子的意思不是不上浓缩胶,而是上一半左右,但浓缩胶的的长度要够,至少要保证蛋白能压在一条线,配完后用水封,上样的时候去水直接上。
3.研磨最好用10ml左右或小一些的高压灭菌管
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wood533[使用道具]
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to 楼上:
1,肯定有影响。考染只是作为一种蛋白的检测手段,检测完毕后,胶就可以丢弃了;如果想保存,可以制成干胶,这个也很好做。如果你要是想放一段时间的话,可以把胶浸泡在含有甘油的水中或脱色液中。
2,KCl染色就是这样,你可以先通过样品的预处理除去其他杂蛋白。我不知道你的试验是什么样子,但如果蛋白是包涵体的话,可以先逐步洗涤包涵体,最后可以把目的蛋白洗的很纯,在上样就容易多了。
3,组织研磨器很效,玻璃的,而且那是相当的便宜。还是推荐你用这个,起码我当初试了很多方法,就这个实用。
4,当然可以上样了,浓缩胶不要加到顶,留一段距离,这样胶和玻璃就可以形成一个很宽的梳孔。
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感谢大家的回应:
我的实验做的是带6个His标签的蛋白,但因为i蛋白太大了,在Ni柱中纯化了很长时间,仍无法得到蛋白,因此,才想到用切胶免疫的。我现在的问题是:
1、用考染在室温下需要的时间比较长,这样的蛋白对免疫会不会产生影响?
2、在配浓缩胶时,不要加到顶,那不会从两边漏出来吗?
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另外的问题
切胶免疫好像不能保证在无菌条件下进行,这对免疫动物不会产生影响吗?
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