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标题:【求助】原核表达时样品处理问题

wzqzy[使用道具]
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发表于 2014-5-20 10:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】原核表达时样品处理问题

诱导后取样品,每1ml菌液离心后加150微升裂解液过夜
过夜后发现前几个时间点裂解较好
最后一个依然浑浊
我超声了很长时间还是不能非常澄清,效果十分有限,于是加大了超声的周期,结果过了10分钟发现竟然变的更浑浊了,难道是我的蛋白变性了?......反复冻融以后还是没有变化
超声真的管用吗?我的样品怎样处理还是最为妥当的呢?
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eric930[使用道具]
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发表于 2014-5-20 10:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

原核表达过后,要确定你的表达的蛋白是不是包函体,就是能不能分泌到胞外。所以首先对上清和菌液沉淀分别进行处理SDS-PAGE电泳，如果在上清当中那比较方便了，杂蛋白相对少些，纯化也更容易；如果在胞内就麻烦一些，要选取适当的处理方案，酶裂解法，超声呀，研磨法，不同样品可能会有些差异，可以试一下。但是有一点要确定，就是用未诱导的做对照的话应该很明显看出差异带，这个差异带应与预测表达的大小相近才对。
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wzqzy[使用道具]
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发表于 2014-5-20 10:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
原核表达过后,要确定你的表达的蛋白是不是包函体,就是能不能分泌到胞外。……

====================================================================================

你没有回答我的问题，现在的问题不是包含体的确定已经蛋白是否表达，现在的问题是样品处理时始终无法澄清
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小游abc[使用道具]
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发表于 2014-5-20 10:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 wzqzy 于 2014-5-20 10:33 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
原核表达过后,要确定你的表达的蛋白是不是包函体,就是能不能分泌到胞外。……

====================================================================================

你没有回答我的问题，现在的问题不是包含体的 ...

其实我认为他已经回答了你的问题。
如果你的蛋白表达了，但是包含体中，那么无论怎么超声，都是依然是浑浊的。另外你取样的目的是什么呢？为什么一定要澄清呢？如果是包含体无论超声还是溶菌酶处理都依然是浑浊的。
超声只要不让温度变的非常高，使蛋白变性的可能性并不大，如果你是放在冰上超声的话。
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wzqzy[使用道具]
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发表于 2014-5-20 10:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我是在冰上超的
不过出现越超越浑浊的情况是正常的吗？而且相当浑浊，比菌刚溶解在裂解液中还浑浊
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发表于 2014-5-20 10:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
是正常的，几乎可以肯定是包含体了。因为包含体完全超声之后，就是白色浑浊的样子。
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wzqzy[使用道具]
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发表于 2014-5-20 10:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我跑了电泳以后发现超出白色浑浊的沉淀蛋白含量明显增多，水溶性蛋白减少很多
而没有超声到这种程度的，水溶性的多，沉淀蛋白量相对较少
难道是我以前超声的不彻底？
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小游abc[使用道具]
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发表于 2014-5-20 10:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
有可能。你的沉淀是用尿素溶的吗？如果蛋白可溶，没有道理会沉淀的。
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发表于 2014-5-20 10:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不可能完全那么澄清的
你想要可溶性蛋白的话就离心一下就好啦
上清很澄清的
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wzqzy[使用道具]
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发表于 2014-5-20 10:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
有可能。你的沉淀是用尿素溶的吗？如果蛋白可溶，没有道理会沉淀的。

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我用的是融菌酶裂解液
有时候融的浑浊我多加一点就澄清很多很多
不知道是真的溶解了还是浓度变低变的澄清了
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