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标题:【求助】目的条带不出来！快疯了！

dodoit[使用道具]
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发表于 2014-5-21 15:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】目的条带不出来！快疯了！


我是06年九月份开始提的蛋白，用的是RIPA强效型裂解液，今年07年开始做的，但到现在做了四次，每次都是内参（我的上样量是50ug/孔）做出来很亮，目的条带不出来，都快急疯了，因为老板说做完实验才能回家过年，要不过年继续做。我的一抗是abcam公司的，二抗是pierce公司分装的，一抗是06年3月份买的，二抗是06年12月过期，但我当时为了验证二抗是否还能用，就直接把二抗和我的ECL显影液混合，结果在暗处有亮光，那说明应该是能用的。我现在一抗都快用完了（100ul包装），还是没有目的带出来，请高手给我指点指点啊！
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发表于 2014-5-21 15:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 dodoit 于 2014-5-21 15:34 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我是06年九月份开始提的蛋白，用的是RIPA强效型裂解液，今年07年开始做的，但到现在做了四次，每次都是内参（我的上样量是50ug/孔）做出来很亮，目的条带不出来，都快急疯了，因为老板说做完实验才能回家过年，要不过年继续做。我的一抗 ...

1 首先确认目的蛋白是否存在于裂解后的溶液中；
2 确认胶上的蛋白确实转出去了；
3 确认你的抗体是针对目的蛋白的；
4 确认你的抗体是用来做WB的，如果不是做WB的抗体用来做WB有可能不能识别；
5 确认你的二抗是有效的，不能直接用显色液来检，需要把一抗固定后加二抗然后再显色确认。
祝你成功！有什么不明白的可以PM我或继续跟帖！
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nn255[使用道具]
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发表于 2014-5-21 15:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
western的问题那真是很多 我给你点经验吧
1.解决样品问题, 你要确定你的样品制备方法准确 有效 可以跑胶直接考兰染色 看有没有很多条带 一般没什么问题 我用pbs+cocktail一样可以抽取蛋白
2.转膜问题 包括许多问题 但是根本就是你要的条带转上去了 你最好用预览marker 我用的就是 可以看见你要得条带大小跑到哪里 转膜后又可以看见对应你目的条带大小的marker是否转上 如果marker条带转上 你的目的蛋白一样可以转上
3.抗体问题 一抗可以加叠氮钠重复使用 你不知到么? 怎么会用完? 抗体一般是浓度问题 但是一次都没有也许就不是浓度问题了 你是否调节过浓度呢? 板内又许多讲浓度的 你取搜吧 如果是抗体过期 谁也没办法的
你检验2抗方法有问题 最好直接向别人借他们用的没问题的
以上是我的经验 希望对你有用
不用谢了 呵呵
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dodoit[使用道具]
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发表于 2014-5-21 15:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

多谢两位的发言啊!!
1首先是我不知道怎么确认我的蛋白在不在裂解液中,但这个方(RIPA裂解液)法我是参考一篇外文文献的
2我的目的条带是39kd 内参是GAPDH30-40KD的,每次marker的对应条带36kd都很清晰的转到了膜上
3我的一抗说明书上说可以WB的,推荐1:500,我就是按照这个稀释的
4我刚才拿丽春红染了一下我昨天做的膜,有很多条带出来啊
5至于叠氮钠我倒没试过,因为抗体还有50ul,但我做过的一抗倒有保存,以后可以一试.
6我今天打电话给晶美公司,技术员推荐我用1:100稀释一抗,而且又买了了新的二抗.唉 只好明天再试一次了!
希望大家继续给我意见啊
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nn255[使用道具]
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发表于 2014-5-21 15:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
叠氮纳终浓度是0.02% 我一般是配1%的 用时1:50加就可以了
有很多条带就是转膜没什么问题
估计还是抗体的问题
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dodoit[使用道具]
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发表于 2014-5-21 15:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #5 nn255 的帖子

正准备说服老板换一抗，100ul就3000元啊，不知老板会怎么反应，不管了，只有豁出去了！
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发表于 2014-5-21 15:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

坚决要求换抗体！
39KD 的蛋白好做的，GAPDH都出来了！这两种蛋白转磨时间什么的要求都差不多。蛋白上样量肯定足够
除非你的蛋白表达极低，核的？膜的？
二抗要用对。
排除了该有的原因之后找一抗，不行就换！
提交product complaint form,让代理公司尽快解决。谁耗的起时间？！
不行买其他的公司的抗体，做出结果让原来的退货回钱。
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发表于 2014-5-21 15:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我遇到的问题同楼主如出一辙，内参beta-actin跑出来了，很清晰，可目的的做了不下十次了，没有结果！抗体分别是Santa和Alexis 公司的，先用推荐稀释浓度范围加一抗（较高1：200），二抗是中杉的（1：10000），Ecl整张膜发光，后来增加封闭时间（置摇床过夜）、洗膜时间和次数，二抗降到14000，就没有光了，再后来想可能是一抗浓度高，就降到400、600都做过，还是不行，没有光！！真是气死了，不知道原因出在哪，老板时不时催着要结果，可它就不出有什么办法。郁闷啊！急切需要大家帮忙分析指教，期待中...
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dodoit[使用道具]
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 小中大

1我做的蛋白是胞浆和胞核都有的，是一种修复酶。
2问过代理公司了，他说时间太久了（06.3买的）。但是没办法，还是要买abcam这个公司的，因为别的公司没得卖。
3高兴的是老板很轻松得答应了重新买一抗的事！但就是又要耽误又一个月的时间，快要毕业了，时间哪里耽误得起！
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zsxan1990[使用道具]
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发表于 2014-5-21 15:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

做实验的时候就要疯,疯了才会出好结果,你是快疯了,再加把尽,马上你就疯了,离成功不远了，哈哈
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