蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】SDS电泳问题

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】SDS电泳问题

okhaha[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77505
精华 0
积分 548
帖子 756
信誉分 100
可用分 4651
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-17
状态 离线
1

发表于 2014-5-22 11:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】SDS电泳问题


本人表达了一个膜蛋白,复性,浓缩后直接上SDS检测,但是sds上根本看不出条带,整个泳道弥散,感觉象是烧胶,降低上样量后,出现了类似彗星状的条带,很奇怪.明天准备降低电泳缓冲液的sds浓度以及降低电泳温度试试,大家还有什么高招?
我的样品里有1%的中性表面活性剂,对电泳有影响吗?
Happy Xmas
顶部
duoduo[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 74511
精华 0
积分 705
帖子 1009
信誉分 100
可用分 5926
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-11
状态 离线
2

发表于 2014-5-22 11:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
看起来像上样前样品没有经过处理，最好是先加上样缓冲液煮5min然后离心后再上样。一般SDS和温度对SDS－PAGE影响不大。
顶部
shenkunjie[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76942
精华 0
积分 712
帖子 1124
信誉分 100
可用分 6420
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-11
状态 离线
3

发表于 2014-5-22 11:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我第一次跑SDS－PAGE胶时，也遇到过你这样的情况，可能有几个原因：
1.想楼上所说的，你可能是没有在上样前处理样品。一般是蛋白样品：4×loading buffer（3：1）。第一次沸水中煮8-10min，以后每次上样前煮5min，高速离心1min后上样。
2.也可能是你上样体积过大，浓缩效果不好。是否减少上样量。如果你的蛋白样品浓度过低，可以用冻干法冻干后再溶增高浓度。或者，你可以适当增长你的浓缩胶的长度，一般是齿梳下1cm，可以适当延长至1.5cm-2cm，延长样品浓缩时间。
3.如果还不能解决，在浓缩过程中，也可以降低浓缩的电压，一般为80V，不过我做过降低为60V，效果不错。可供参考。
最后，祝你成功。
顶部
66+77[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75637
精华 1
积分 596
帖子 785
信誉分 103
可用分 4751
专家分 20
阅读权限 255
注册 2011-10-26
状态 离线
4

发表于 2014-5-22 11:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

问下楼主，你浓缩时候用什么方法？
顶部
ending[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76092
精华 0
积分 771
帖子 1242
信誉分 100
可用分 6981
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-1
状态 离线
5

发表于 2014-5-22 11:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

样品没有处理好或者上样量太大了
脱盐并减少上样量试一下
顶部
okhaha[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77505
精华 0
积分 548
帖子 756
信誉分 100
可用分 4651
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-17
状态 离线
6

发表于 2014-5-22 15:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

非常感谢各位,我表达的这个蛋白是一个膜蛋白的膜结构域部分,有β barrel的结构,完整蛋白复性后,sds电泳的时候根本不存在现在这种情况,所以我怀疑是β barrel的影响.在sds电泳中,复性后的蛋白和包涵体有明显的迁移率差异,这也是我估计复性率的根据,所以我的样品不能变性处理.
to bacteria_virus
大量浓缩用vivi cell 100ml每次,小量用cenmicron 0.5ml每次.
happy new year
顶部
okhaha[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77505
精华 0
积分 548
帖子 756
信誉分 100
可用分 4651
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-17
状态 离线
7

发表于 2014-5-22 15:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

今天用了2%SDS的缓冲液,降低了电压以及电泳温度,从预染marker的表现看有微弱的烧胶现象,分离胶和积层胶处有大量的蛋白聚集,看来是个难缠的蛋白.
顶部
wood533[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76132
精华 0
积分 863
帖子 1385
信誉分 100
可用分 7745
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-1
状态 离线
8

发表于 2014-5-22 15:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我觉得电泳的电压和温度对条带有影响，我也出现过楼主的问题，调低电压，冰上电泳，并且在电泳过程中一直注意电流要尽量稳定。后来这个问题就解决了。
顶部
xue258[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75643
精华 0
积分 746
帖子 1171
信誉分 100
可用分 6696
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-26
状态 离线
9

发表于 2014-5-22 15:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
大量浓缩用vivi cell 100ml每次,小量用cenmicron 0.5ml每次.
vivi cell 和cenmicron 是什么东西？望指点，谢谢
顶部