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标题:【求助】如何提高抗体纯化的得率？

plaa[使用道具]
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发表于 2014-5-22 16:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】如何提高抗体纯化的得率？


大家好！
我最近在纯化抗体，由于细胞表达比较低，仅3微克/毫升左右，在过ProteinA时，回收率仅为50%，其中流速大小、温度等的因素都可以排除，是不是表达过低才是主要因素，我柱子上样量约40ml/ml胶，即100微克蛋白/ml胶？还有什么办法能提高回收率，ProteinA回收率应该有80%以上吧？
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mimili_901[使用道具]
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发表于 2014-5-22 16:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不同样品是不一样的,你可以先用离子柱富集再过亲和柱也许会好点,收率低应该还有测定误差等.你可以把穿透的再过柱子看看.如果挂不住,那说明确实是没有了.
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发表于 2014-5-22 16:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

3mg/L的表达量是比较低了，国外一般都可以做到1~2g/L，小规模可以做到5g/L。
你的抗体种属亚型如何？
不同的抗体与protein A亲和力不尽相同，binding条件是否合适，并且洗脱方式也是影响收率的重要因素。
如果你的抗体和柱子亲和力并不弱，binding条件也基本合适，那么0.1mg/ml的进样量显然远远小于载量，不管使用常见的哪一家的柱子，不管是纯化那种抗体，只要适合用proteinA来纯。
我做protein A亲和纯化，收率应该可以在97~99%是没有问题的，这是我多次长期的大量数据积累，应该是具有一定的统计意义。
有关你的实验信息，你还是要说的更详细一些。
至少先做物料衡算，看看损失到底在哪里？
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plaa[使用道具]
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发表于 2014-5-22 16:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
测定误差是有点，我是用ELISA来定量的（因为浓度实在太低），在测定同时插了一个已知2微克的标准品，结果测出约2.2微克，所以误差在20%左右，穿透出来的样品检测基本没有蛋白，重新过柱子，也没有东西挂上柱子。都不知道损失部分在哪里？
binding条件是pH8.0，洗脱pH3.0，流速（1ml预装柱）0.25ml/min和1ml都试过结果多差不多，过柱的温度都在冰浴中进行。
你们说是不是这么低浓度在挂柱子过程中降解了？
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u234[使用道具]
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发表于 2014-5-22 18:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

proteinA 的回收率其实是最可以让人放心的,只要你的proteinA填料没什么问题.
这种亲和纯化的亲和力是很强的.
相对来说柱子细长,binding条件合适,上样量不超过柱子理论载量的一半,一次过柱下来应该就有90%以上的回收率.
我感觉你觉得回收率低,问题还是出在这个测定的方法上,ELISA法IgG定量确实有误差,尤其是当IgG浓度很低的时候.
比较严格也严密的方法可以这样做:
用理论载量超过实际上样量1倍多的柱子,反复的纯化一个样品（上样-平衡-洗脱-再平衡-再上样……）这样重复纯化2，3次，估计99%的IgG就被抓出来了，然后那最后一次纯化的流穿去做Western Blotting,用抗Fc的一抗，检测是否还有IgG残留，基本上这样做，能检测出极微量的IgG残留。
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plaa[使用道具]
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发表于 2014-5-22 18:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢各位的指点，想想应该是检测的问题，Elisa检测到的都是纳克级的。
再问一下，各位说的的ProteinA回收率99%，是用什么来定量的，是不是用
SDS-PAGE和BCA综合考虑的？我想我还是等提高表达量后再来考虑得率吧。
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发表于 2014-5-22 18:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的收率就是用Elisa定量，不管用什么方法，至少物料应该可以衡算的。
WB如果可以检测到，ELisa也没有理由不行，而且还是定量。
提高ELisa的可靠性，可以考虑同一个样作不同稀释度，每稀释度作复孔，在线性范围内的，求平均值。还可以考虑严格的做一下方法学研究。
culture中这么低的表达量，BCA测flow through的蛋白应该是基本没什么用的。
洗脱峰可以用UV（已知摩尔消光系数）,或BCA来测（已知浓度的同一蛋白作标准品）。
动态载量与抗体种属亚型、柱高、线速度、抗体浓度、binding条件、温度都有关系，如果目的是做工艺优化，那对不同的抗体都要严格的做穿透，才能知道DBC是多少；如果只是随便做做拿到一些抗体，那就随便找个条件做就可以了
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PINK[使用道具]
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发表于 2014-5-22 18:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

ELisa的误差有一部分在于稀释误差，对于浓度低的样品，这部分误差反而会小，这是因为不必稀释太多倍数。
但有时候还是有一定的随机性。
你的柱高和线性流速是多少？
另外。“理论载量”是怎么得来的？是指静态吸附试验得出的载量么？
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plaa[使用道具]
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发表于 2014-5-22 18:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我用的柱子柱高是2.5cm,线速度40cm/h，就是用GE 1ml的预装柱，我的洗脱峰都是用Elisa 检测的，上样时的量远远不到胶的载量，0.1mg蛋白/ml胶.
Elisa检测我都是用复孔检测，稀释的倍数是在200倍左右，所有实验都是动态吸附。
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PINK[使用道具]
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发表于 2014-5-22 18:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你的总进样量只有 0.1mg /ml beads x 1 ml beads = 0.1 mg
这么少的量，分析收率意义实在是不大，可能吸附损失都不能忽略了。
主要问题在于表达量低，但是以你的表达量，300ml的体积对于1ml的柱子是有点大了。不过如果只是为了一次性的拿到些样品，可以这样做一次，别天天做就行。
建议：至少进样量在mg级，最好进柱前进行一定的浓缩。然后再物料衡算看看。
如果是做产品，那你不用着急，这样的表达量离生产实在是太远，等表达量提高至少十倍再开始吧。
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