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标题:【求助】我的蛋白为什么在BL21中不表达?

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发表于 2014-5-23 15:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】我的蛋白为什么在BL21中不表达?


最近两个月一直在做蛋白表达. 我使用的载体是pET32a, 宿主菌采用BL21 trxB(DE3), 我插入的外源片段长约为1.9 kb, 菌落PCR 酶切及测序结果均无误. 晚上接种, 过夜培养, 次日早上转接, 继续培养至OD值约为0.6时加如IPTG开始诱导. 我已改变了IPTG浓度(1 mM, 0.5 mM, 0.2 mM) , 培养温度(37, 28, 22度), 经过SDS-PAGE检测均无目的条带产生. 请问师兄师姐有什么好的办法? 还是宿主菌不合适? 但是很多人都认为BL21的功能很强大, 换其他宿主菌是不是更难表达出蛋白?
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发表于 2014-5-23 15:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

转一个32的空质粒，看20K 左右是否有表达，确定不是IPTG的问题
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发表于 2014-5-23 15:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果还有其他宿主菌，不妨试试。很有可能在BL21里没有表达，在其他宿主就表达了。
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发表于 2014-5-23 15:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢同仁们的指点, 我有32的空对, 20k 左右条带很明显, 想问问大家PET系统都用过哪些宿主菌, 可否给我推荐几个大家用过感觉比较好的菌种.
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发表于 2014-5-23 15:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我用了9,28,32,44,转bl21de3都表达了，不知道你前期对克隆的鉴定作的怎么样，还有不知道你在转化以后挑了多少克隆来做表达，我最近发现，同一批转化出来的克隆有些会表达有些不会，具体原因不明
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发表于 2014-5-23 15:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

诱导系统没问题，测序又正确（没有移码）的话，个人觉得yourgm战友的建议值得一试，有时候是说不清原因的。另外有两个问题是否要考虑一下：
1 蛋白毒性的问题。按理说既然在BL21中转化出来了，就应该没事，因为LB中可能含有痕量的lactose，所以在铺板子的时候可能就已经诱导目的蛋白开始表达了。而且你也已经将该菌接到LB中培养到了OD 0.6. 通常，如果一个蛋白具有毒性，在转化时可能根本长不出菌，或者长出的菌大小不一，不规则，或者根本在液体培养的时候长不出来，还有，需要长很长时间才能到你所要的OD值。
但是，如果蛋白毒性不是很大，而在overexpression的时候发生剂量效应的话可能会引起蛋白不能表达或表大量低。解决的办法，可以查查一些专门表达毒性蛋白的菌株。很多公司都卖这个的，找到它们，作为关键词搜一下，如果方便要到菌株的话可以试一试。
2 稀有密码子问题。这个可以通过一些网站，园子里就有这种介绍（我以前就发了一个链接，呵呵），查查是不是这种情况。如果是，也有一些菌株可以干这个事，比如codon plus. 或者通过点突变改变密码子了（就是比较麻烦）。
通往成功的路线是唯一的或者少数的，但太多的岔道可能导致失败。所以，以上仅供参考。
Bless
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发表于 2014-5-23 15:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
pET系统很强大，但不是每个蛋白都能在这个系统中表达，这涉及到很复杂的因素，比如楼上提到的细胞毒性和稀有密码子问题。pET提供的是强启动子，在表达细胞毒性大的蛋白质时会给细胞带来很大伤害，如果改变诱导条件不能表达的话，可以更换启动子比较弱的质粒，比如pGEX系列，它使用的是tac启动子和GST融合蛋白，也许可以表达你的蛋白。
你还可以先用western鉴定一下你的蛋白到底有没有表达，也许只是表达量比较小，如果是这种情况仍然可以进行亲和纯化。
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发表于 2014-5-23 15:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果是稀有密码子的问题，你可以选用Rossatta菌株。
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发表于 2014-5-23 15:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢各位的建议, 我一开始也怀疑是表达量低的问题, 就用Western检测了一下, 分别使用了His-tag抗体和我蛋白的特异性抗体, 但均无目的条带产生, 因此可初步断定蛋白没有表达, 我现在将质粒转化到了DH5α中, 因为听别人说DH5α也可以表达蛋白, 不知道有没有人用这个宿主菌做过表达? 我现在手里到是有pGEX系统的质粒, 如果换了宿主菌还做不出来, 我会考虑换pGEX质粒. 谢谢大家给了我这么多的好建议, 让我在黑暗中可以看到一丝曙光!
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 小中大

DH5α不是表达菌，只是克隆菌。
看看两者的基因型：
DH5a: F- endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG Φ80dlacZΔM15 Δ(lacZYA-argF)U169, hsdR17(rK- mK+), λ–
BL21(DE3): F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5])
其中，ompT = mutation in outer membrane protein protease VII, reducing proteolysis of expressed proteins
而DH5a里不存在这个突变，即使表达了也会被降解的
另外，外源DNA在DE3中是受T7强启动子控制的，能overexpression.
是否有其它原因偶也不知道，请高手继续...
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