【求助】硫酸铵沉淀得不明白

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标题:【求助】硫酸铵沉淀得不明白

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发表于 2014-5-24 15:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我将上星期纯化出的单抗用50%硫酸铵沉淀，10000rpm离心，沉淀用10ml pbs溶解（为了提高浓度，应该为40mg/ml左右）并用pbs透析，透析后抗体体积变为18ml，离心最后上清紫外测浓度。但过程中出现了两个问题。
一是透析后的抗体中出现了絮状沉淀，而且是灰色的，感觉很脏，离心后管底有黑色沉淀，不知道是何物。
二是测浓度时发现抗体浓度只有预想的一半，而且抗体总量只有沉淀之前的一半，硫酸铵沉淀会引起这么大的损失吗？
我现在一直都想不明白为什么抗体中会有黑色沉淀，而且又损失了这么多，大家帮帮我吧。。。

plaa[使用道具]
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发表于 2014-5-24 15:30 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你用的那个公司的硫酸铵？有的质量不好不纯，就有很多杂质，黑色的可能就是杂质。还有你配置硫酸铵溶液时没有调解PH到中性，否则硫酸铵溶液是酸性的，会使抗体变性，就产生絮状物

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发表于 2014-5-24 15:30 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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腹水
硫酸铵是北京化工厂的分析纯，是不是有杂质不得而知.
不过硫酸铵确实没有调ph，因为我们过去都没有调过，沉淀血清腹水都是这用的，没有出现过问题。
我沉淀了一天一夜，说不定真的是由于ph的问题。得去测测。。。

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发表于 2014-5-24 15:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

刚刚用试纸测了硫酸铵的ph,是6.5左右,这样的ph会有这大的影响吗?我损失的抗体都成为了透析时的絮状吗 ?

plaa[使用道具]
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发表于 2014-5-24 15:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

建议你配好较浓的，如饱和硫酸氨，调好PH再加到单抗里面
还有你用PBS溶解时全部都能溶解吗？（溶解时吹大不要太猛烈，会引起抗体变性）如果可以的话那可能时因为你透析后抗体浓度太高析出了，形成絮状
还有那个黑的应该还是试剂中带入的杂质

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发表于 2014-5-24 15:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我刚调了ph，还不知道效果，可惜不能用同批的抗体对比了。
pbs溶解后没有见到固体，室看起来像乳浊液的感觉，40mg/ml好像也不是太高吧，然后我就透析了。
离心后管底除了一点黑色的东西并没有太多的抗体沉淀。好像沉淀过程中损失应该更多，只是推测。

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发表于 2014-5-24 15:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

再上来说说我的情况。
我现在依然用硫酸氨沉淀，沉淀后离心，上清中检测基本没有抗体，但上清看上去有一些混浊，沉淀溶解为高浓度抗体溶液，测一下含量发现比沉淀之前损失了一半，哪去了？到现在我也不知道。
有人有类似的经验吗？指导一下小可。。。

兔唇[使用道具]
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发表于 2014-5-24 15:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

建议你用质量好一些的硫酸铵产品（比如广东光华），好的硫酸铵配制成饱和溶液后肉眼看过去非常均一，无任何杂质。我就曾用过不好的氯化钠产品，溶解后有非常多杂质，从此我就再也不买那些不放心的产品了。
硫酸铵沉淀一定要调正确pH值。如果你的硫酸铵纯度不够高，就会使得你配制的饱和度比你预想的偏低，自然就无法将溶液中的所有抗体都沉淀下来。建议你换一个牌子的硫酸铵试试吧，我们一般把pH调到7.2。

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发表于 2014-5-24 15:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

现在也觉得硫酸安是个问题,实验真是需要摸索,不过为这些问题摸索实在是有点累...

gogo[使用道具]
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发表于 2014-5-24 15:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1、盐析时硫酸氨的浓度本来就是要摸索的，楼主为什么要用50%的浓度，合适的硫酸氨浓度是摸索出来的，浓度主要跟蛋白的种类和浓度有关。
2、你用紫外法测浓度，测的是你样品里总蛋白含量，硫酸氨沉淀前后，总蛋白含量当然会有变化。为什么不测效价呢.
3、黑色的东西估计不会是盐的问题，应该是腹水里的里的东西。
总的建议是用硫酸氨分级沉淀法，应该会解决这个问题。

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