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标题:【求助】关于蛋白诱导表达的问题

seven7[使用道具]
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【求助】关于蛋白诱导表达的问题


各位朋友:
我最近在做白细胞介素-7的诱导表达时,遇到一些问题亟需各位高手相助!
下面是我的实验条件:(宿主菌是BL21,目的蛋白2万左右)
1、 取重组菌的种子50ul转接至5ml LB中37℃过夜培养。
2、按4∶100比例稀释过夜菌,一般将2ml菌加入到含50mlLB培养基(含0.2%葡萄糖)的500ml培养瓶中, 37℃震荡培养2小时;
3、取部分液体作为未诱导的对照组,余下的加入IPTG诱导剂至终浓度1.0mM作为实验组,继续于30℃、200rpm震荡培养7hr,每个小时取样一次;
4、分别取菌体1ml,4℃离心12000g×1min收获沉淀(收获全菌);
5、用100ul SDS凝胶加样缓冲液重悬菌体,100℃水浴5分钟,离心12000g×1min,取上清液20ul 上样做SDS-PAGE等分析;
问题是:跑完电泳,用考马斯亮蓝染色后,脱色,在胶上没办法看到诱导成功的条带,只有菌体浓度的变化? 请各位高手给小弟分析分析,多谢了!


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2014-5-24 18:00
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tangxin_80[使用道具]
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为什么没有marker?
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flower-201[使用道具]
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1,过夜培养种子的时候,温度可以低一点,30度足够,防止菌种长老
2,过夜培养的种子,转接到摇瓶中的时候,可以直接按照1:100的比例转接
3,诱导前合诱导后的样品也可以从摇瓶中直接取样,省点事,当然,你单独做个对照也没问题
4,你的载体是什么?有无标签?另外IL-7用原核表达,一般都会形成包涵体,而且目前还没有复性方面的报道,一般来说,白介素都是真核表达的,所以你的目的是得到有活性的蛋白,还需要考虑到这一点。
5,蛋白不表达的原因有很多。除了诱导表达条件之外,和蛋白本身性质、密码子偏好、启动子强弱、载体性质、宿主菌都有关系。你可以尝试用其他载体或者宿主,重新转化质粒。
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seven7[使用道具]
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上周蛋白已经诱导出来了,非常感谢!
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你改变了哪些实验条件,能不能给大家讲一讲啊?
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大虾,我看你的胶很漂亮啊,请问你染色和脱色是如何进行的,我的胶老是脱不干净啊,至少没有你这么干净
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QUOTE:
原帖由 NBA 于 2014-5-24 18:01 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你改变了哪些实验条件,能不能给大家讲一讲啊?

版主,我主要是改了诱导的温度(37度),还有诱导的时机( 测菌浓达到0.8时开始诱导的)
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QUOTE:
原帖由 bring 于 2014-5-24 18:02 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
大虾,我看你的胶很漂亮啊,请问你染色和脱色是如何进行的,我的胶老是脱不干净啊,至少没有你这么干净

我的脱色主要是在60度下进行的(一般只要1小时就好了,染色60度10~30分钟),这样比较干净也比较快
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fsdd817[使用道具]
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你原来不是37°摇的吗?
你是说IPTG从1.0降到0.8就诱导出来了吗?表达量高吗?能不能把图贴出来看看呀
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is2011[使用道具]
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应该是A600=0.8时诱导,即600nm的光吸收。
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