小中大 表1 最佳溶剂体系选择表
极性较弱溶剂 最佳溶剂 极性较强溶剂
heptane, CHCl3 THF H2O
heptane, toluene, MiBK, CHCl3, EtOAc ACO H2O
heptane methyl ethyl ketone H2O
THF DMSO H2O
toluene, MtBE, MiBK, EtOAc MeCN H2O
heptane, toluene, CHCl3, EtOAc BuOH H2O
heptane, toluene, CHCl3, EtOAc PrOH H2O
heptane, CHCl3, EtOAc EtOH H2O
heptane, toluene, CHCl3, EtOAc, BuOH MeOH H2O
heptane, toluene, CHCl3, MiBK, EtOAc, BuOH HOAc H2O
CHCl3 HCOOH H2O
非水体系
Heptane THF, DMF, EtOAc, PrOH, EtOH MeOH, MeCN
heptane, 正戊烷;CHCl3,氯仿;THF,四氢呋喃;toluene,甲苯;MiBK,甲基异丁基酮;EtOAc,
乙酸乙酯;ACO,丙酮;DMSO,二甲亚砜;MtBE,甲基叔丁基醚;MeCN,乙腈;BuOH,正丁醇;
PrOH,正丙醇;HOAc,乙酸;HCOOH,甲酸;DMF,N,N-二甲基甲酰胺。
三. 逆流色谱技术在抗生素分离纯化中的应用
逆流色谱技术已经成功用于许多抗生素的分离纯化,这些抗生素的结构类型有肽类、大环内酯类、四环素类、蒽环类、放线菌素类、多烯类、核苷类、糖类和头孢类等,详见表2。
表2 逆流色谱分离的部分抗生素
样品 仪器 溶剂系统 流动相 发表时间
肽类
短杆菌肽A,B,C DCCC C6H6-CHCl3-MeOH-H2O LP 1974
HSCCC C6H6-CHCl3-MeOH-H2O LP 1982
短杆菌酪肽 DCCC CHCl3-MeOH-0.1MHCl LP 1974
多粘菌素E(抗敌素) CPC n-BuOH-2%CHCl2COOH(5%NaCl) LP 1984
多粘菌素 分析HSCCC n-BuOH-0.04M TFA(1%glycerol) LP 1991
杆菌肽 x-axis CCC CHCl3-95%EtOH- H2O LP 1989
Foam CCC N2, H2O 1989, 1991
HSCCC CHCl3-MeOH-H2O LP 1991
HSCCC CHCl3-EtOH-MeOH-H2O LP 1991
WAP-8294A HSCCC n-BuOH-EtOAC-0.005M TFA LP 2001
四环素类
土霉素/氯霉素 CPC n-BuOH-0.01MHCl LP 1984
四环素/杂质 CPC nitromethane- CHCl3-pyridine-0.1MEDTA(pH7) LP 1984
四环素 DCCC CHCl3-MeOH-n-PrOH-0.01MHCl LP 1984
大环内酯类
Niphimycin DCCC CHCl3-MeOH-H2O LP 1983
红霉素 CPC MiBK-AcO-0.2M phosphate/ citrate buffer(pH6.5) LP 1984
2-去甲基红霉素 HSCCC n-C5H12-C6H6-AcO-iPrOH-0.01M citrate buffer(pH6.3) UP 1988
尼达霉素 HSCCC CCl4-MeOH-0.01MK3PO4 buffer(pH7) UP 1988
Tiacumicins HSCCC CCl4-CHCl3-MeOH-H2O UP 1988
Coloradocin HSCCC CHCl3-MeOH-H2O UP 1987,1988
孢绿菌素 HSCCC n-BuOH-Et2O- H2O LP 1990
霉菌素 分析HSCCC n-C6H14-EtOAc-MeOH-8%NH3.H2O LP 1991
Dunaimycin HSCCC n-C6H14-EtOAc-MeOH-H2O UP 1991
原始霉素 HSCCC CHCl3- EtOAc-MeOH-H2O UP 1992
伊维菌素 HSCCC n-C6H14-EtOAc-MeOH-H2O LP 1996
螺旋霉素 HSCCC n-C6H14-EtOAc-MeOH-H2O UP 2000
蒽环类
道诺红霉素衍生物 HSCCC CHCl3-CH2Cl2-nC6H14- MeOH-H2O UP 1981
阿霉素/道诺红霉素 CPC n-BuOH-0.3M Na2HPO4 LP 1984
/代谢物
Benzanthrins A, B HSCCC CCl4-CHCl3-MeOH-H2O UP 1986
Altromycins CCC CCl4-MeOH-H2O, n-C6H14-EtOAc-MeOH-H2O LP 1990
喹喔啉类
棘霉素/醌霉素 CPC ACO- H2O-nC5H12-EtAcO LP 1978
三骨菌素A/棘霉素 CPC CCl3CH3-MeOH-H2O UP 1978
放线菌素类
放线菌素混合物 HSCCC Et2O-nC6H14-MeOH-H2O UP 1986
多烯类
曲古霉素 CPC CHCl3-MeOH-borate buffer UP 1984
Globoroseamycin CPC CHCl3-MeOH-borate buffer UP 1984
制霉菌素 CPC CHCl3-MeOH-borate buffer LP 1984
呋罗托霉素 HSCCC CCl4-CHCl3-MeOH-H2O UP 1985
克念菌素 HSCCC CHCl3-MeOH-H2O UP 1987
核苷类
Herbicidins A, B CCD CHCl3-MeOH-H2O LP 1976
头孢类
其它
Pentalenolactone HSCCC CHCl3-MeOH-H2O UP 1985
(内酯)
Tirandamycin A, B HSCCC n-C6H14-EtOAc-MeOH-H2O UP 1985
Siderochelin A HSCCC CHCl3-MeOH-H2O UP 1985
A 201E HSCCC CCl4-CHCl3-MeOH-H2O UP 1985
Bu 2313B HSCCC n-C6H14-CH2Cl2- MeOH-H2O LP 1985
SCH 42282 HSCCC CHCl3-MeOH-H2O UP 1998
(含糖大环内酰胺)
本文作者等用国产分析型TBE-300高速逆流色谱仪(深圳同田生化技术有限公司)对含环孢菌素A、B、C、D的混合物进行分离,以石油醚/丙酮/水(V/V 3:3:2)为溶剂系统,下相为流动相,运行8小时后,得到纯度大于98.5%的A、B、C、D各组分,收率高于85%。事实证明高速逆流色谱技术在抗生素分离纯化方面大有可为。
四. 逆流色谱技术的新进展
1. 梯度洗脱逆流色谱:高速逆流色谱通常使用恒定比例的溶剂系统,但是对于组分极性变化大的样品,用恒定比例的溶剂系统难以达到分离效果。此时可以像HPLC 一样采用梯度洗脱的方法进行分离。先用简单的梯度洗脱系统如水-乙腈(100:0O:100)用HPLC对样品进行极性扫描分析,选择适当的溶剂系统,如正己烷-正丁醇-甲醇-水(极性化合物);正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(中极性化合物)和正己烷-乙腈(非极性化合物),然后逐渐改变系统中某一溶剂的比例,如将正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水体系中甲醇的比例从0.1逐渐提高到2.5并求出不同甲醇比例时的分配系数以优化溶剂系统,最终得出最佳梯度洗脱系统。花色素苷 (anthocyanins)是一种类黄酮类植物色素,是很好的抗氧化剂和自由基清除剂。由于结构中羟基和糖苷基的数目不同而使各组分的极性不同。以乙酸乙酯-正丁醇-水(0.2%TFA)为溶剂系统,采用逐渐提高流动相中正丁醇比例的方法对样品进行梯度洗脱逆流色谱,一次既可分离出5个活性成分。
[ 本帖最后由 hplcangel 于 2010-9-15 15:08 编辑 ]