小中大【求助】目的基因在大肠和酵母中都不表达?
基因为1800多bp,最初是克隆到表达载体pPIC9K中,转化毕赤酵母GS115,提转化子的基因组DNA,经测序基因和读码框都正确,诱导发酵后跑SDS-PAGE,改变诱导条件后重复多次还是没有表达目的蛋白。
后又尝试原核表达,载体是pET30a,宿主菌BL21,酶切位点是Sal I和Not I,上游酶切位点Sal I后加了两个碱基以保证读码框完整,经测序基因和读码框也都是正确的,转化到BL21后用菌落PCR验证,劈出的条带大小也符合。然后就是摇瓶发酵,当OD600=0.6左右时加IPTG至1mM,4小时后取样,超声破碎,分别取上清和沉淀跑SDS-PAGE,就是没有表达目的蛋白。
现在什么能试的方法都试过了,诱导物浓度、诱导时间、诱导温度、破碎缓冲液,甚至摇床转速都试过了,真是拿它没折了,请做过表达的有经验的大虾们分析一下,看看究竟可能是哪里有问题,万分感谢!!!
后来又克隆了另一个基因2400多bp,还是用pET30a,也没有表达。