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标题:【求助】蛋白表达问题

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发表于 2014-5-28 10:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】蛋白表达问题

我的目的基因克隆到质粒pET32a中，然后转入ＢＬ２１中进行表达，但是经过诱导后不表达，经过测序目的基因是正确的连接到了载体中，我已经做了好几次诱导表达了，可是始终不表达，不知道什么原因，请各位支支招，很急，先谢谢了
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发表于 2014-5-28 10:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可是融合蛋白在ＢＬ２１中表达了呀
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发表于 2014-5-28 10:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你说的的融合蛋白在ＢＬ２１中表达了是什么意思？是跟什么蛋白融合进行表达的，是融合在目的蛋白的N端还是C端？
如果融合能够表达的话那密码子肯定没有问题，我觉得问题出在RNA二级结构的几率比较大。RNA的二级结构尤其是N端的二级结构直接影响着翻译起始效率，尤其是在核糖体结合位点附近的二级结构。
如果你的蛋白融合在目的蛋白的N端，因为融合蛋白的RNA肯定没问题，所以你的蛋白可以表达；当融合蛋白不存在的时候，就直接是你的目的蛋白RNA的N端与上游相接，因此你的目的蛋白N端RNA的结构就直接影响着蛋白质翻译起始效率。
推荐一个软件RNA structure，可以分析RNA结构。如果确实是它的问题可以通过同义密码子的互换来改善。
祝你好运！
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xyw5[使用道具]
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发表于 2014-5-28 10:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我遇到过类似情况
以前我是用pET28表达的，测序结果也是正确的，可用BL21死活表达不出来，重复过好几次，后来又到别的实验室找了个同样的菌株，一下子就出来了。再后来，我又换了 pET32和 pGEX载体，利用实验室原有的BL21都能表达出来，至于其中原因，我也说不明白。
所以，我认为你可以：
1.尝试换用或改变表达菌株
2. 对转化入BL21的菌落，做个菌落PCR，看目的基因是否转进去了
3.如果还不行，就得看看所用的载体有没有问题
个人愚见，如有不妥，切勿见笑！
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发表于 2014-5-28 10:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

是融合在目的蛋白的N端,就是利用pET32a上启动子后面的蛋白，然后把目的基因加在NcoI酶切位点的后面。结果是这个融合蛋白一下子就表达出来了。
可是利用质粒pET32a直接表达BL21和目的基因转入质粒pET32a后再在BL21中表达，但是质粒pET32a表达出来了，可是带目的基因的质粒却表达不出来。
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发表于 2014-5-28 10:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

还有我这个目的蛋白很小的，只有几十个氨基酸，那么二级结构也影响蛋白的表达吗？
请发给我一个分析二级结构的软件，谢谢了
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发表于 2014-5-28 10:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 49888 于 2014-5-28 10:37 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我的目的基因克隆到质粒pET32a中，然后转入ＢＬ２１中进行表达，但是经过诱导后不表达，经过测序目的基因是正确的连接到了载体中，我已经做了好几次诱导表达了，可是始终不表达，不知道什么原因，请各位支支招，很急，先谢谢了 ...

pET32a质粒一般不在BL21种表达，楼主得换宿主菌，用BL21（DE3）就没问题了
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发表于 2014-5-28 10:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我用的宿主菌就是BL21（DE3）
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发表于 2014-5-28 10:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
蛋白样品沉淀有没有跑个电泳看看,是不是都形成包涵体了.
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发表于 2014-5-28 10:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主用的基因5‘用的是NcoI吗？你选择载体的时候就不能用pet32a，因为NcoI的位点是CCATGG，由于这个酶切位点有ATG，载体表达的时候是按NcoI上的这个ATG开始的，这样就移码了，我就是吃了这个亏，建议楼主先查查是不是我说的这个问题，如果是的话用pet32c或者在NcoI后面再加两个碱基就可以避免移码突变。
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