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标题:【求助】WB转的一张膜上能同时结合两种或更多次一抗吗？

purrr[使用道具]
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发表于 2014-5-28 15:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】WB转的一张膜上能同时结合两种或更多次一抗吗？


我刚开始准备做WB，因标本收集很难，提的蛋白也较少，请教WB时，转的一张膜上能同时结合两种或更多次一抗吗？或结合一种一抗后，洗3次后再与另一种一抗孵育？（此前需要牛奶封闭吗？）还是显影后再洗脱后再可结合另一种一抗？？请各位有经验的老师们发表发表意见，请各位不吝赐教，已救燃眉之急！！！！另：准备购买质量好的一抗，避免延误实验的进行，请各位有经验的老师们发表发表意见，那个公司的一抗质量最好？R&D?Sigma?State?ABCAM??? 或其他？？？不胜感激！！！
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is2011[使用道具]
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发表于 2014-5-28 15:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你时用的什么膜阿？millipore的PVDF可以用蛋白解吸液将抗体及封闭液洗掉，然后重新封闭，重新加抗体就行了。详见millipore公司
cuturl('http://www.millipore.com/') ，搜索Immobilon ，可以下载各种型号的说明书。我把我用的Immobilon－PSQ说明书附在后面了！ 一抗的质量R&D，Sigma，ABCAM的都挺好的，就是santacroze（大概这么拼的吧）的种类多，但质量不敢恭维。晶美公司代理的ABCAM的抗体现在有活动－买一抗送内参一抗，挺好的，我买了他们公司的，要比sigama的便宜。
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tuuu2[使用道具]
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发表于 2014-5-28 15:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
转的一张膜上能同时结合两种抗体，我做过的，效果也挺好的。多次抗体孵育我没做过，理论上可行，但是效果就不知道了。做发完光后，用TBST洗三次膜，然后再用封闭液封闭2h后者过夜，然后再用另一个抗体孵育。但是要注意，用DAB显色过的不能重复孵育。
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remenb[使用道具]
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发表于 2014-5-28 15:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可以的，只要你第一次显色后再重新充分用PBS洗涤，然后再孵育你的第二个一抗，效果还是不错的。我以前经常这样做的。
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summerxx[使用道具]
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发表于 2014-5-28 15:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

在Western Blotting试验中，完成第一轮杂交后，经常需要重复使用同一张膜，进行第二次/第三次杂交，最为常见的情况包括：
(1) 内参杂交。
(2) 信号传递研究中，检测其他目的蛋白。
(3) 检测目的蛋白的磷酸化(phosphorylation)或甲基化(methalation)后，继续检测总目的蛋白的表达。
利用同一张膜进行多次蛋白检测，不仅节省蛋白样品、省略蛋白电泳和膜转移等耗费性步骤，而且可消除重新上样带来的误差，使可比性更强。
进行新一轮杂交前，需首先去除第一轮杂交时结合在膜上的一抗和二抗。传统的方法是使用具有强烈刺激性臭味的b-巯基乙醇， 55℃水浴振荡30分钟，操作极不方便。
我用的是华特生Western Stripping Solution 不用b-巯基乙醇，室温20～30分钟，可去除前一轮杂交时结合在膜上的一抗和二抗。可重复使用2～4次。
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purrr[使用道具]
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发表于 2014-5-28 15:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我在说明书里未找到具体的"用蛋白解吸液将抗体及封闭液洗掉，然后重新封闭，重新加抗体就行了"呀？我要测的蛋白是50几KD的，蛋白解吸液就是TBST吗？R&D的一抗您用过吗？它附有阳性对照吗？希望得到更多的信息。谢谢。
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发表于 2014-5-28 15:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问：“华特生Western Stripping Solution 不用b-巯基乙醇，室温20～30分钟，可去除前一轮杂交时结合在膜上的一抗和二抗。可重复使用2～4次。” 需要震荡吗？现在室温低可以吗？可以去除前面已和相应的抗原结合的一抗吗？？？（我总觉的已和相应的抗原特异结合是较强的，而不易被解开）还是未结合的多余的一抗和二抗？并请问，前几位使用的TBST 洗脱，就是华特生Western Stripping Solution 吗？用TBST洗脱可以吗？能重复使用2～4次吗？效果怎样？还请多多指教为谢，谢谢！！！
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发表于 2014-5-28 15:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我用的是华特生Western Stripping Solution 不用b-巯基乙醇，室温20～30分钟，可去除前一轮杂交时结合在膜上的一抗和二抗。可重复使用2～4次。

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不知您所说的“华特生Western Stripping Solution ”是购买的还是自配的，每次处理的时间都固定吗？望不吝赐教！
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plaa[使用道具]
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 小中大
我在说明书里未找到具体的"用蛋白解吸液将抗体及封闭液洗掉，然后重新封闭，重新加抗体就行了"呀？我要测的蛋白是50几KD的，蛋白解吸液就是TBST吗？R&D的一抗您用过吗？它附有阳性对照吗？希望得到更多的信息。谢谢。

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R&D公司的抗体我正在用，感觉还可以，至少我是做出来了！但我认为该公司并不是很让人放心的公司，记得当初在分装抗体时（—20度保存，没有santa和CST的＋4度保存的抗体方便），说明书和包装上均没有说明抗体的浓度而只有抗体的质量数，让我无法稀释使用！通过代理公司沟通，才知道是由于R&D疏忽没有在说明书上标明，重新给我发来说明书补充！
我做的是glut4
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yes4[使用道具]
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 小中大
不知您所说的“华特生Western Stripping Solution ”是购买的还是自配的，每次处理的时间都固定吗？望不吝赐教！

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买的.北京的欣源嘉和就有卖的
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