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标题:【求助】表达的蛋白比标准大小小好多,怎么办？

Darcy[使用道具]
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发表于 2014-5-28 16:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】表达的蛋白比标准大小小好多,怎么办？

各位战友:
我表达了一个蛋白,在大肠杆菌中表达，但是其大小比标准品的大小要小十几KD,但是在DH5a中表达的时候，双酶切鉴定大小又是对的,测序测不出来，在BL21中表达后挑菌提蛋白,跑SDS-PAGE,大小又不对,可是用双抗夹心ELISA检测,用单抗包被,多抗夹心检测自己表达的蛋白,又有颜色反应.
有没有高手帮忙帮忙!谢谢
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remenb[使用道具]
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发表于 2014-5-28 16:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #1 Darcy 的帖子

等测序吧,没有序列的话还是不好说
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taoshengyijiu[使用道具]
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发表于 2014-5-28 16:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
很多人遇到这种情况，最好打质谱，氨基酸测序，就会完全确定
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Darcy[使用道具]
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发表于 2014-5-28 16:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

哪家测序公司比较好，价格也还合理啊？
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cwcwcww[使用道具]
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发表于 2014-5-28 16:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

是不是因为遗传密码的问题，楼主是否注意过这个问题？
因为“不同物种有不同的密码子偏爱性，如果外源蛋白中含大量大肠杆菌的稀有密码子，特别当这些稀有密码子呈连续分布的时候，就会造成蛋白表达量极低，或者翻译提前终止。”
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发表于 2014-5-28 16:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你是在什么载体中表达的蛋白，会不会是你设计的引物中的终止密码子对蛋白的翻译没有完全的终止，使其还在继续表达载体中的序列，就造成了分子量大的现象，你的ELISA之所以可以做出来，是因为你的目的蛋白形成的结构不受后续碱基编码序列的影响所以显出阳性，要是想解决的活就再多加几个终止码使其完全的终止，或使用较轻的终止码，以前我也遇到过这种情况，如果你的后续工作部要求目的蛋白为天然的，那么多几个氨基酸也是没什么问题的，可是筛库或是制单抗就不行了。
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发表于 2014-5-28 16:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

BIOKINASE说的很对
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jkobn[使用道具]
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发表于 2014-5-28 16:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问一下你的目的蛋白最初是来源于真菌或者本身具有糖基化的特点？如果这样子可能由于 原核生物表达系造成表达蛋白缺少糖基，分子量小事可以理解的。不过测序测不了，让人有些不明白。
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Darcy[使用道具]
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发表于 2014-5-28 16:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我是在PET28A中表达的，因为是大肠杆菌表达，BL21，所以糖基化的可能性应该比较小，而且我的基因是人工合成的全基因序列，应该也不存在那些问题啊。现在我重新诱导出来，结果有两条带，一条就是原来表达的那个比较大的带，一个好像就是目的带了，但是如果我要做单抗免疫又应该怎么做呢？
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