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标题:【求助】求BIO-RAD等电聚焦24cm胶条的protocol

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发表于 2014-5-28 16:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】求BIO-RAD等电聚焦24cm胶条的protocol

原先用的是公司提供的17cm的protocol，但聚焦效果不好，故求24cm胶条的protocol，不知道前辈们有没有经验？
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发表于 2014-5-28 16:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我是贴壁细胞裂解的样品,摸索后定下来的方案是:
50V水化14h, 1000V,linear,1h; 10000V,linear,5h; 10000V,rapid,90000vh;500V,rapid,20h(保持)._水化聚焦温度均为20度.供参考.
公司的protocol不是通用的,用来跑标准品效果也不一定好.所以,我一般不用公司的protocol. 不同的样品有不同的最佳条件,这个需要我们自己摸索.
17cm的效果不好,换成24cm的效果不见得就能好.先确保样品制备ok,再往下摸索聚焦条件. 特别是往下要做大通量实验时,这一点更重要.
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豆龟[使用道具]
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发表于 2014-5-28 16:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问linear和rapid有什么区别？
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 小中大

回复 #3 豆龟 的帖子

linear 为线性升压，电压变化和时间呈线性关系；而rapid为快速升压，设定时间的前部分电压变化较快。样品没问题的情况下，两种情况都是在设定时间范围内达到设定的电压。也有盐离子浓度高等情况无法达到最高电压的情况。
一般样品盐离子低时可以设置为快速升压，盐离子高时设置为线性或慢速升压。（因为从升压结束到进入聚焦步骤电压均为10000V，所以属于快速的步骤转换，也有直接在升压步骤中设置总的聚焦vh的，我原来用amersham仪器时就是这样的）
盐离子高时还可以适当延长低压时间，以尽可能地去盐。但这样的方法去盐能力有限，关键还是样品制备。
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qianqin1977[使用道具]
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发表于 2014-5-28 16:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也是做的贴壁细胞，做的时间也不短了，但一直做不太好！前段时间跑了一张图感觉还可以，但是这两次又重复不出来了，如果再做不出来的话可能老板就不让我做了，但是我又不甘心，毕竟做了这么长时间了，所以现在很郁闷那！
我的处理方法是在裂解液中加入ＤＴＴ（６５mM）,超声裂解后放置２小时，然后１２００Ｒ／Ｍ离心，然后丙酮沉淀过夜，风干后用水化液重悬（加入ＤＴＴ浓度达１８mM），作用２小时后测浓度．上样前２００００转离心．你认为这样的处理方法有问题吗？因为你的样品也是贴壁细胞，应该有可比性．
还有，请问你在ＩＥＦ前样品处理中加了 DNAase I，RNase A 和Mgcl2了吗？Mgcl2这步是必须的吗？这样不是会增加样品中的盐离子浓度？不加会影响效果吗？
还有，你ＩＥＦ的总电压伏小时那不是达到了１４０００？
你是浙江农大的吧？
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发表于 2014-5-28 16:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
样品处理时,我也加入65mMDTT,没用超声波处理(我们的超声波探头太大,我总掌握不好会出气泡),只是用振荡器.振1~2min后放冰上,过一会再振1~2min,反复10-15次.高速离心后上清分装,测定浓度就上样了.我没有用丙酮处理,怕蛋白丢失严重.
这样处理后的样品总的来说小分子量点分的不错,但大分子量部分总有横纹.点还有点发虚.
样品处理我加了两种核酸酶,还有对应的Buffer(里面有MgCl2),增加盐离子是难免的,但加的不多,水化上样进一步稀释,应该影响不大. 不加的效果如何我没有对比过,没有发言权.
我的总VH一般是110000,有点大了,但我的样品这个条件还算适合.
总的感觉是,即使同是贴壁细胞,处理方法也不一定相同.哺乳动物细胞核酸特别多，这个应该是样品处理中最应该注意的环节。
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qianqin1977[使用道具]
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发表于 2014-5-28 16:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
非常感谢!
那就是说你用的不是nuclease，而是你自己买的DNase\RNase A了，那你的ＢＵＦＦＥＲ也是买的公司的？我现在用的是进口分装的DNase\RNase A,然后自己配的溶液，虽然加了之后发现溶液不粘稠了，但总怕核酸去不干净（因为文献报道在高浓度尿素溶液中会将核酸酶灭活）！
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发表于 2014-5-28 16:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

买了TakaRa的，buffer是配套有的．
＂加了之后发现溶液不粘稠了＂说明是有效果的．
＂高浓度尿素溶液中会将核酸酶灭活＂这也是我一直担心的问题，但感觉用了核酸酶比不用好．你觉得呢？
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发表于 2014-5-28 16:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

＂高浓度尿素溶液中会将核酸酶灭活＂,我以前也担心这个问题,但当我看到加入核酸酶后粘度明显消失的过程后,还是坚信核酸酶有作用的.
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qianqin1977[使用道具]
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发表于 2014-5-28 16:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这是我最近作的一次，感觉比以前好多了，但是总觉得图有点怪，大家帮忙看看，给点建议。谢谢！


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