【求助】老题目-关于变性与非变性蛋白电泳区别

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标题:【求助】老题目-关于变性与非变性蛋白电泳区别

daod[使用道具]
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发表于 2014-5-28 16:24 资料个人空间短消息加为好友

小中大

各位战友,小弟我近日非变性电泳总是跑不好,而变性电泳正常,不知道什么原因,请多多指教啊.
我的loading buffer:total 1ml(0.25ml 0.1%溴芬兰,0.1ml 0.5M浓缩胶buffer,0.65ml 去离子水)
我的running buffer:total 1L(6g Tris,28.8g glycine)
浓缩胶电压55V,分离胶电压为110V.整个电泳时间不超过60分钟,溴芬兰的线就到胶底部,当时室温28度左右.而最后考马斯亮蓝染色结果是,在胶的顶部(浓缩胶与分离胶交界)似乎有条带.
我的蛋白是经Nonagen公司histag柱纯化的大肠杆菌表达的重组蛋白,分子量为25KD左右,分离胶浓度为12%,却看不到条带,我实在费解,所以请各位非变性电泳高手指点一下,在此,我非常感谢!!!

ritou1985[使用道具]
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发表于 2014-5-28 16:25 资料个人空间短消息加为好友

小中大

没弄明白,非变性胶,就一张胶片,怎么还农出来个两层胶片啊
我跑了那么多非变性胶都是一张的哦
可能是我寡闻吧,

daod[使用道具]
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发表于 2014-5-28 16:26 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请问楼上的兄弟,你的是怎么操作的,可以说详细吗?我在这方面查的文献比较少,请多多指教啊!!!

vcve[使用道具]
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发表于 2014-5-28 16:26 资料个人空间短消息加为好友

小中大

10X TBE  1.0ml
40% Acrylamide（40%聚丙烯酰胺） 3.3ml
50% Glycerol（50%甘油）  1.0ml
dH2O（蒸馏水）  14.8ml
TEMED（四甲基乙二氨） 20µl
脱气10min
10% AP（过硫酸氨）  100µl

vcve[使用道具]
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发表于 2014-5-28 16:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

这个配置方法,我做EMSA实验,跑非变性胶用了好多次! 拿到不少很漂亮的图片,自认为比较爽!
当然港开始数据不是这样的,原数据配置做的结果不是很好,这是改进了的,还好吧

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发表于 2014-5-28 16:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

哦,忘说了,浓度是6.5%的PAGE, 希望各位占有能借鉴上

daod[使用道具]
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发表于 2014-5-28 16:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

忘了,你上面的10*TBE,可不可以换成TAE,还有总体积是20ml,为什么10*TBE只需要1ml,请多多指教,呵呵.
另外,你看我的loading buffer的配方可以用吗 loading buffer:total 1ml(0.25ml 0.1%溴芬兰,0.1ml 0.5M浓缩胶buffer,0.65ml 去离子水)
真是谢谢大家有空为小弟解决问题,我真是很感激,呵呵.

vcve[使用道具]
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发表于 2014-5-28 16:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我电泳用的是0.25*TBE 所以做凝胶的时候也用TBE来配置,在PH上与电泳缓冲液保持一致!总体积20ml主要考虑凝胶中相关成分的离子浓度;
这个是我经常做EMSA时候要跑非变性凝胶的配置方法,不知道你做什么实验!

ii077345[使用道具]
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发表于 2014-5-28 16:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

Loading buffer 里加点甘油(终浓度10%)可以促进蛋白的溶解。浓缩胶与分离胶交界有条带经常是由未充分溶解蛋白或蛋白分子量较大引起。