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标题:【求助】多肽纯化和鉴定

dior[使用道具]
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发表于 2014-5-28 16:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】多肽纯化和鉴定


一个多肽粗制品,含量约为2.5%,其他成分为食盐,未知蛋白和其他未知成分,溶解度很低,大概只有1mg,溶解度随pH降低略有升高,pH越低越稳定.
分子量约3500,含34个氨基酸,含有的氨基酸分别是: Ile,Ala,Leu,Pro,Gly,Lys,Met,Asn,His,Ser,Val,DHA,DHB,ABA
我打算用凝胶过滤或离子交换法层析纯化提取这个多肽,用亲和层析做成本太高,各位有什么好的建议和看法?
关于检测,这个多肽并没有在280nm处有吸收的酪氨酸和色氨酸,那么我还能用紫外作为检测手段吗?相关文献有用280nm作为检测值的,我认为不合理?我定性扫描的结果在200nm左右有比较大的吸收,但我认为在这个波段的干扰太大,大家觉得呢?
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ROSE李[使用道具]
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发表于 2014-5-28 16:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

建议用反相半制备柱，检测波长214nm，可能会分得比较好，但是杂质不能太多。
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pengke1983[使用道具]
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发表于 2014-5-28 16:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
好像说多肽一般都用220左右的把
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sunnyB[使用道具]
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发表于 2014-5-28 16:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问：你是用酵母发酵得来的吗？
如果是的话：因盐浓度太高，你第一步用凝胶过滤的话，效率会十分低的，并且大量的盐分有可能同你的目标肽一起流出。
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dior[使用道具]
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发表于 2014-5-28 16:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

据说是植物蛋白发酵的，我买的是市售粗品，溶解之后可以闻到很浓的酵母味，那么如何除去这个杂质呢？好像我过柱下来之后还是有的
我有先通过透析除去盐再过柱的，结果也不理想
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发表于 2014-5-28 16:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

3500的分子量用g10,g25应该能脱盐的吧.个人认为第一步采用凝胶应该有用的。检测波长254,280,220可以分别比较一下,然后选一个.估计也就是吸收峰高度有差别,基本不会漏掉的.然后再用离子交换把.
这种方法处理的量不大.
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发表于 2014-5-28 16:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

C18 column, 214 nm, use A. water w/ 0.1% TFA and B. acetonitrile w/0.1% TFA.
After sample was loaded on the column, inject some water to rinse to remove salt. Then use the gradient to separate.
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qianqin1977[使用道具]
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发表于 2014-5-28 16:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
多肽纯化，反相柱是首选。低ph和乙腈或甲醇还可以大大增加多肽的溶解度。
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dior[使用道具]
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发表于 2014-5-28 16:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

没做过反相层析，不是很了解，spring_come的方法看起来不错
反相柱一般用什么规格和品牌的？
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3N4G[使用道具]
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发表于 2014-5-28 16:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

有专用的多肽柱C18的 是安捷伦公司的 这是我们用的
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