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标题:【求助】溶菌酶破大肠杆菌,半年了没破好

kulee[使用道具]
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发表于 2014-5-29 13:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】溶菌酶破大肠杆菌,半年了没破好

由于要保证我抽屉蛋白质的活性,且在没有超声波的情况下,我用进口分装Amresco 的溶菌酶破大肠杆菌,半年了,摸索各种条件,pH 8.0,pH剃度啊,加与不加0.1mMEDTA,NaCl浓度剃度啊,4度或37度啊等,不管时间长短,始终没有看到变粘的现象啊,各位大虾,快帮帮我啊我快疯了啊!
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发表于 2014-5-29 13:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这个并不是溶菌酶的问题，有的裂解液是很难直接破菌的。
你可以试试NOVAGEN的bugbuster裂解液，如果自己摸索条件的话，可以考虑其他因素的影响，建议添加EDTA、去垢剂（非离子型的NP40、triton x-100，离子型的脱氧胆酸钠、十二烷基肌氨酸钠、或者SDS等），单独用溶菌酶是很难破菌的。
如果有超声条件，其实并非不能得到可溶上清，关键是控制条件
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发表于 2014-5-29 13:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

真是无知者无畏,半年时间就光研究这个了?
早不发问,早干吗去了?
溶菌酶破胞是最不可预测和控制的
直接4度超声!!没有超声设备去别的实验室借用
还有一点市场上很多所谓的裂解液本身破胞的作用并不强,里面也就是利用盐离子和酶和一些去垢剂来破胞,但这些是不稳定的东西,一般要加上超声或者反复冻溶才有好的结果.
想用溶菌酶偷懒破胞的,还是老老实实用最简单最实用的方法吧
PS,真佩服这位同学,半年了,就磨蹭在这么简单的破胞上??
是不是想发个关于破胞研究的nature,science还是cell啊?
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发表于 2014-5-29 13:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
可能老板是搞临床什么的吧
恐怕自己不会这方面的实验,也不过问学生在忙什么.
到时候毕业的时候,又不知道是怎么弄出来的论文和答辩.
现在太多这样的丑闻了,似乎在中国这都不算丑闻
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kulee[使用道具]
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发表于 2014-5-29 13:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我用了8mM的EDTA和1%的Tritonx100啊,也没见过有什么效果啊

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为什么说"溶菌酶破胞是最不可预测和控制的?

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的确上这样的啊
我昨天用了一只新的别人送外给我的酶,我现配了用一下 ,变粘了.我高兴了一晚上,放在四度过夜了.可今天来了之后发现效果变差了很多,然后又新配了一管
感觉效果更差了,以前也碰到这中情况,新到的酶当天试用很好，可第二天又不行了啊怎么回事啊
它这么不稳定吗
救救我啊
超声波把别人借烦了别人已经不借了,老板不是搞这个的,前些天还把我猛批了一顿
当时真想跟他翻脸啊
他还要我测它在各种条件下 的火星再用啊
我郁闷死了
买NOVAGEN的bugbuster的 又没钱啊
我该怎么办啊?我该怎么办啊?我该怎么办啊?我该怎么办啊?我该怎么办啊?我该怎么办啊?
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qianqin1977[使用道具]
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发表于 2014-5-29 13:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我觉得你没必要在摸索破菌的条件了，明确对你老板说，都用超声的，没这么折腾破菌的，没那个功夫，让他看着办吧
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发表于 2014-5-29 13:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
超声波好象对蛋白质有损伤吧
我用来做GSTPULLDOWN的 啊 有一对相互作用以前就是用lysozyme 做出来的
后来用超声波就没做出来过啊
所以他不要我用超声波啊
不知道怎么办啊
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发表于 2014-5-29 13:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

合理的超声一般是不会破坏蛋白质的,总的原则是"短工作时间,长间隔,4度冰浴"
超声条件控制好,防止过热,具体的超声条件现在也很难和你说,这个取决于不同的超声仪和探头,你可以做几个不同超声时间的对照组,然后去做pull down
如果实在没法超声,那一般也只能反复冻溶再加所谓的裂解液,继续漫漫磨蹭吧,直到要毕业的时候,你可以发个文章或者给各大生产裂解液的公司写封信,就说我为你们做了长期的对比实验,得出什么什么结果,问问他们愿不愿意买你的文章哈哈
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duoduo[使用道具]
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发表于 2014-5-29 13:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

哦还忘了回答一个问题
为什么说"溶菌酶破胞是最不可预测和控制的?
因为裂解液是通过盐离子,渗透压和一些酶和一些去垢剂来破裂细胞的,但是考虑到不同的细胞后者菌的膜结构和成分不一样,不同厂家公司的裂解液的效果是不一样的!
而且有些蛋白质存在与细胞器里面,你光破了外面的膜也没用
所以裂解液+超声是最好的破胞方法
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pengke1983[使用道具]
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发表于 2014-5-29 13:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

细菌裂解最彻底的方法就是超声裂解，但超声裂解一定要控制好超声的强度和时间。要保证蛋白的活性而不变性，一定要控制超声时不要产生气泡，裂解后离心收集上清，若蛋白浓度过低可将蛋白装入透析袋中，用PEG20000浓缩即可，但要适度以防蛋白变性。
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