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标题:【求助】关于蛋白脱盐和浓缩，请教各位高手！

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发表于 2014-5-29 16:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】关于蛋白脱盐和浓缩，请教各位高手！


我想对我的蛋白提取液进行脱盐，然后再浓缩，想去做双向电泳。因为是新手，所以向各位高手求教：
1 我的目的蛋白是55KD，盐浓度比较高，用什么方法脱盐呢？我想用超滤，请问该如何选择超滤离心管？超滤时如何加入缓冲液？直接加入我要的最终浓度的缓冲液吗？离心几次就可以达到我要的盐浓度呢？如何操作呢？
2 有老师建议用透析，我做过透析，时间长不说，总是有不少的沉淀析出，有点担心，请问透析和超滤那种好一些？
3 脱盐之后，如何确定盐浓度是你要的盐浓度呢？只要看你加入的和透析所对的缓冲液的浓度就可以了吗？
4 脱盐之后如何浓缩呢？超滤应该就有浓缩的作用吧！
问题比较多，不好意思，第一次做，对各位高手的帮助先谢谢了！
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daod[使用道具]
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发表于 2014-5-29 16:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我都是透析脱盐的，浓缩则用PEG20000
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发表于 2014-5-29 16:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不知你的蛋白质样品是大量还是微量的，如果是微量的，如几毫升的话。建议你用超滤管进行超滤，省时省力。你的目的蛋白是55KD，所以你可以选择购买截留分子量是50K或者30K的超滤管，超滤管的截留分子量有很多范围，如3K、5K、10K、30K、50K、100、300K、1000K等。最大离心力依你买的超滤管种类而定，我常用的是截留分子量为3K的那种,离心力不要超过12000×g。一个超滤管30元左右，做起来很省时省力。
将你欲浓缩和脱盐的蛋白溶液加入到超滤管中，在4度下，离心半个小时或者一个小时，然后再加入你所要的终浓度的缓冲液，反复离上三次，基本上就可以达到你的即浓缩又脱盐要求了
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发表于 2014-5-29 16:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主既然是想做双向电泳，估计需求的样品量不需太多，所以还是用超滤管吧。
如果你的样品量很多时，可以选择用透析进行脱盐。此外，用PEG反透析进行浓缩，一般处理的大部分是大体积溶液。不好之处是溶液污染样品
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kswl870[使用道具]
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发表于 2014-5-29 16:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
上面打错字了，不好之处是“容易”污染样品。
sorry
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发表于 2014-5-29 16:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
感觉我做的超滤效果蛮好的。不存在损失问题啊。 我一般是离三四次，这个没有严格要求的。第一次是10000g离心一个小时，超滤管里面的液体基本上很少了，然后再添加想要的缓冲液，再离上几次，就差不多了。我没有进行盐浓度测定。但跑电泳的效果感觉不错。 PEG反透析的操作是：把蛋白质用透析袋包好，然后将其包埋在PEG20000中，很快蛋白溶液中的水分就会被吸干。所以进行PEG浓缩时，要严格控制好时间。
说这种方法溶液污染，是因为当将透析袋从PEG中拿出来时，由于PEG吸收水分后，会变得很粘，粘在透析袋上，因此还得需要冲洗，不易操作，尤其是当你的蛋白溶液很少时，建议不要用这种方法。
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wmp1234[使用道具]
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发表于 2014-5-29 16:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

超滤是个较好的方法，快速，而且产物对于双向凝胶电泳来说基本上是没有影响的，但是有一点值得注意，超滤后有些蛋白会损失活性，这是我在研究中发现的，特地提个醒！
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yapuyapu[使用道具]
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发表于 2014-5-29 16:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

本人近来也做了一点蛋白的浓缩，觉得特别是少量蛋白浓缩的时候不建议采用PEG。很浪费蛋白，装在透析袋里，浓缩的速度很快，不容易控制时间，不小心就干了。如果冲洗的话，等于又稀释了。个人觉得超滤的方法还可以。不知道，有人用过冷冻干燥吗？我用过一次，觉得还可以，效果不错。目前很多的浓缩都是采用这个。
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