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标题:【求助】做WB蛋白浓度低怎么办？

大尾巴[使用道具]
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发表于 2014-5-29 17:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】做WB蛋白浓度低怎么办？

我准备做WB提了好多蛋白，当时没做蛋白定量。现在定量OD值多在0.6左右，请问有什么浓缩的办法使蛋白浓度增高？急！万分感谢！
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xyw5[使用道具]
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发表于 2014-5-29 17:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
用5XSDS上样缓冲液，这样蛋白样品和缓冲液比例是4：1；还有就是煮沸蛋白变性的时候可以适当打开EP管盖，让水分挥发点，WB还是比较灵敏的，所以不要太担心
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大尾巴[使用道具]
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发表于 2014-5-29 17:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
蛋白样品和缓冲液最大量能加到多少微升？我以前都是加到25ul，二者比例20:5. 另外，煮沸让水分蒸发会不会影响二者的比例，影响跑胶的效果？还有，WB要求蛋白质量最少是多少？我刚开始做WB，很多不懂，请不要见笑！
谢谢！
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mickeylin[使用道具]
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发表于 2014-5-29 17:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

好象可以检测到钠克级
建议用发光法显色，较DAB显色提高1000倍灵敏度
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cwcwcww[使用道具]
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发表于 2014-5-29 17:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

最主要是你在提蛋白的时候裂解液可少加点，这样可以提高总蛋白的浓度，OD值在0.6左右太小了，直接会影响到你下一步加样时上样量的大小，要是需要大点的上样量的话，上样孔会负载不了。可用10×buffer的上样缓冲液，可使体积更小点儿。0.2um的PVDF膜可检测到2～5ng(影响中是）的蛋白，但是总蛋白的上样量需要摸索（根据目的蛋白的表达量），楼上战友说得对，用ECL比DAB灵敏的多，如果你的上样量不足，最好还是用ECL检测。
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summerxx[使用道具]
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发表于 2014-5-29 17:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你的od值0.6难道是没有稀释的原液，那也太小了啊！不过用化学发光法应该还有可能做出来。试试才知道。
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bangqi_k[使用道具]
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发表于 2014-5-29 17:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
找不到怎么办？
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小野花[使用道具]
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发表于 2014-5-29 17:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

除了wgqsdams 的建议之外，还有一个方法，如果上样量太大，一次上不了，可以先上一部分，等跑下去一点之后再加，反正要经过浓缩胶浓缩的，不会有影响。
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sunnyB[使用道具]
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发表于 2014-5-29 17:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
使蛋白浓度增高还有一个办法，就是使用冻干机使蛋白浓度提高。呵呵，不过这种方法很昂贵啊，如果实验室有可以试一试是可行的。wgqsdams 战友说的有道理，在提蛋白的时候裂解液可少加点，这样就可以提高浓度了。还有一个办法就是用较厚的电泳玻璃片（具体的我记不清了，应该在1.5cm左右吧，我们通常用的是0.75cm的上样量25ul），上样量可以达到100ul。仅供参考，祝好运！！！
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大尾巴[使用道具]
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发表于 2014-5-29 17:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢楼上给我战友的指点！
我想每次提完蛋白后就定量，然后将计算好的蛋白量与缓冲液按4：1混合后煮沸，保存，下次做WB时直接拿来就可以了。这样有俩个好处：1避免蛋白降解 2避免每次做蛋白定量损失蛋白。不知这样做是否可以？保存温度？我问师兄师姐有的说可以有的说不行需现用现配，请指教！谢谢！
l另外，10xbuffer是用来做SDS/PAGE的上样缓冲液吗？我知道的10xbuffer是DNA上样缓冲液啊！二者是否可以通用？
祝各位战友一切顺利！
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