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标题:【求助】tricine sds page 为什么“微笑”得这么厉害？

queen[使用道具]
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发表于 2014-5-30 15:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】tricine sds page 为什么“微笑”得这么厉害？


我的tricine sds page，marker很好，可是蛋白样品“微笑“如图：
我用的甘油，参考的是分子克隆系列的《细胞实验指南》。
书上的上样缓冲液中没用SDS，我为了方便就直接用的普通的上样buffer，据说没有影响，而且，marker的buffer中也有2％sds。
上层：40V，1h；下层：30mA，3h。
为什么呢？恳请高手指点。


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2014-5-30 15:57
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zhenxin[使用道具]
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发表于 2014-5-30 15:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

跑电泳应该在4℃环境，低温进行。

可是你的Marker 没有这个现象，是不是样品问题
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tangxin_80[使用道具]
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发表于 2014-5-30 15:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

样品太粘稠了，拖尾严重。不是胶的问题，检查loading buffer是否配制正确，样品需要充分变性，减少上样量
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发表于 2014-5-30 15:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

样品太粘稠了，拖尾严重。不是胶的问题，检查loading buffer是否配制正确，样品需要充分变性，减少上样量
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发表于 2014-5-30 15:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我相同的样品，跑普通的SDS-PAGE很好。
我电泳时，放在了冰浴里的。
应该把loading buffer里的sds去掉？
书上的loading buffer
50mmol/L tris
12%甘油
2％巯藉乙醇
0.1％溴酚兰
看起来和一般的loading buffer 很不同。
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发表于 2014-5-30 16:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

感觉是loading buffer的问题。实际上用sds-page胶的loading buffer跑tricine胶没什么问题，我长期这么干，问题是loading buffer的保存，不管是用的哪种还原剂（DDTor2-ME）时间长了都不行，Ph值更直接影响结果。建议重新配制。
此外，不知道楼主跑的胶是10%的tricine胶还是16%的，在分离胶中还是采用的恒压比较多吧，我们常规120v。
具体还可以参考nature protocol的一篇关于tricine-sds-page的免费sample文章，很详细的。
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发表于 2014-5-30 16:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
好像是loading buffer的问题。我觉得是里面的SDS不够，你的上样缓冲液是放在冰箱里保存的吗？建议你加前要把buffer加热，混匀SDS再加入样品，样品的量适当减少。实在不行就重配buffer。
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发表于 2014-5-30 16:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

电压是不是有点太低了？我门最少都是150V！！
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04906[使用道具]
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发表于 2014-5-30 16:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

还有加好buffer要煮沸10min中的
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queen[使用道具]
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发表于 2014-5-30 18:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢热情帮忙！
我决定用新的loading buffer 再试试！
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