【求助】我的EMSA条带是特异性结合的条带吗？

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标题:【求助】我的EMSA条带是特异性结合的条带吗？

tewank[使用道具]
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发表于 2014-5-31 09:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我最近在跑转录因子激活蛋白－1（activator protein-1，AP-1）的EMSA。对结果有两个问题
1。加入非标记特异性探针竞争，100倍和150倍的，都没有使蛋白－DNA结合条带明显减弱，但是加入AP-1的亚基之一c-fos的抗体后，条带完全消失。那么这个条带到底是不是特异性结合条带呢？如果是，为什么150倍的非标记探针都阻滞不了？
2。条带的位置非常靠上，几乎是没有离开点样孔多远，底下的自由探针条带各个孔不是形成很整齐的一条线，但是上面的特异性结合条带很整齐。我怀疑这个条带根本就是积累在点样孔中的蛋白-DNA。为什么会这样？如果是蛋白－DNA没有跑下去，有什么解决的办法?

tewank[使用道具]
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发表于 2014-5-31 09:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

AP-1由c-fos和c-jun组成，分子量也有100kDa了，比较大。我在考虑是否能够把PAGE胶的浓度调小，由6％减到4％，或者把丙稀酰胺：甲叉丙稀酰胺的比例由30：1调整到60：1，这样可能特异性条带能够跑下来，不知道行吗？
还望各位战友不吝赐教！

jkobn[使用道具]
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发表于 2014-5-31 09:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

呵呵,你啊,我前几天刚帮个朋友做完EMSA, 是AP-1 和nfkb两个转录因子,不过我有事马上得出去

loli[使用道具]
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发表于 2014-5-31 09:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼主所说的蛋白我没有接触过，但据我的经验提几个建议：
1，可以试试同位素标记的核心binding序列突变的探针，如果这个有binding证明非特异
2，条带下不去或者不进胶我一般的办法是换buffer（TBE，TAE和TGE都可以试试），换pH
3，楼主蛋白上样量是不是太多了？多了跑不下去的
4，蛋白或者蛋白复合体大并不一定代表binding的位置靠上，我所做的蛋白很小，只有27kD，位置也很靠上；我一个同学做的蛋白大小也是26kD左右，位置却比较靠下。

tewank[使用道具]
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发表于 2014-5-31 09:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

把胶的浓度从6％调整到4％后，明显在孔下一段距离有条带，加入抗体或者非标记探针能减弱条带，所以考虑还是我所需要的特异性结合条带。
根据楼上的答复，请问蛋白－DNA结合的迁移位置和什么有关呢。是否蛋白分子量越大，DNA越长，条带越靠上？我在同一块胶上跑AP1和NF-kappaB，探针都是22个碱基，两个转录因子形成的条带居然在同一高度上，到底是巧合还是别的？
另外，我抽提的核蛋白原来测的浓度比较高，在5－6ug/ul，冻融过两次，再测浓度降低到1－2ug/ul。我在第二次测浓度以前，按第一次的浓度，计算加入15ug的量跑EMSA，现在看来只加了2ug多的核蛋白量，居然也跑得出条带来？是冻融的影响确实有这么大，还是我测的浓度很不准？我可是用BCA法挺仔细的测的。

loli[使用道具]
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发表于 2014-5-31 09:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼主所讲'是否蛋白分子量越大，DNA越长，条带越靠上？"
我觉得不一定，我同学做的EMSA，蛋白大小和我所做的差不多，，标记的片段我用的是42bp，他用的是多个500bp的区段。按楼上所说应该他所做的binding条带相对位置在我所做的上面，但实际结果是相反的。我们这边还有人做和我所做蛋白属于同样一个大家族的EMSA，蛋白大小差不多，保守结构域完全一致，标记片段长度也和我差不多，但binding位置确很靠下。所以别觉得binding位置和单一的蛋白大小或者DNA长度成一定的相关性。
还有，楼上的是不是浓度太高了？我每次所用量为1ug，我同学甚至用800ng或者更低。冻融方面我觉得不会有问题，我用过pirece公司的盒子，里面提供的标准样我都不知道反复冻融过多少次，一样做出来相当好的结果。不知道楼主跑的蛋白是哪方面的？蛋白是通过什么方式纯化出来的？洗脱buffer会不会有影响？冻融如果真的影响浓度的话，是不是有蛋白析出的情况存在？我做的是植物蛋白，不敢过多的乱加评论。

tewank[使用道具]
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发表于 2014-5-31 09:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

看来EMSA似乎比Western要来得诡异？如象楼上所说的那样，我想是不是由于EMSA是非变性胶，并且和DNA结合，所以蛋白在电泳中会保持原有的或产生新的复杂的构象，从而影响迁移率，所以蛋白－DNA复合物条带位置，不同于WESTERN，和蛋白及DNA的分子量大小并无一定相关性，实际是这样吗?那么，要确定一个蛋白－DNA复合物条带的大概位置，就只有查文献了吗？
我的核蛋白是从心肌组织中提取的，不好意思，比较懒，直接用的国产的核蛋白抽提试剂盒。我查文献，和我做同样指标同样组织来源蛋白的，日本人有用5ug 蛋白的，美国人甚至有用10mg来做的，觉得有点匪夷所思。
后一次测蛋白浓度，为了防止蛋白降解，顺便每个样品里又加了少量蛋白酶抑制剂，不知道有没有用。

loli[使用道具]
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发表于 2014-5-31 09:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

回复 #7 tewank 的帖子

我总算明白楼主原来是在用细胞核里面抽提出来的总蛋白做的EMSA了，晕倒，我还一直以为你也是用原核表达后纯化的蛋白做的。难怪你要用抗体来作竞争性分析，难怪你要用那么多量的蛋白。好像这样的结果不是很可靠吧？至少不能说明特异性binding。我记得植物方面有人也有这个做的，就是把某些处理后的总核蛋白提出来，然后做个EMSA，结论是某处理后相关的转录因子开始起作用；然后用原核表达后纯化的他们关注的那个转录因子再做EMSA，这样才能确定是特异结合的。我记得这两个EMSAbinding的位置是一致的，当然动物方面我不好乱说了，实在是不懂。

tewank[使用道具]
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发表于 2014-5-31 09:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

原来loli同志是做植物的。如你所说的那样做EMSA，就我看过和了解的文献，可能是1）要研究的转录因子了解得比较少，具体的作用位点特点尚不清楚；2）或者是确定某种转录因子确实能和特定基因上游启动子中的一段序列结合，参与转录调节，因此才需要表达纯化转录因子蛋白，并用要研究的启动子序列相作用。是这样吗？
我做的两种转录因子，是在各种实验中做得非常多的两种常见的转录因子，其激活机制相对比较清楚，无论是动物实验也好，细胞实验也好，用抽提的核蛋白来做EMSA，主要是探讨干预因素对这些转录因子激活的影响，因此还必须用抽提的核蛋白来做呢。所用的探针序列，也是常用的公认的和转录因子有最佳结合能力的序列。对这类转录因子的这种实验，即使象JBC等较权威的杂志上，有些也只是用非标记探针竞争以确定特异性结合条带就可以了呢。我们老板不放心，才让我加抗体求保险的。